化学品 EASZY试验 利用转基因 tg（cyp19a1b：GFP）斑马鱼胚胎通过雌激素受体检测内分泌活性物质

1化学品EASZY试验利用转基因tg（cyp19a1b：GFP）斑马鱼胚胎通过雌激素受体检测内分泌活性物质本文件规定了化学品EASZ试验利用转基因tg（cyp19a1b：GFP）斑马鱼胚胎通过雌激素受体筛选内GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试GB/T21803化学品快速生物降解性DOGB/T21831化学品快速生物降解性密闭瓶法GB/T21855化学品与pH有关的GB/T21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验GB/T21857化学品快速生物降解性改进的OECDGB/T27850化学品快速生ISO6341水质-对大型溞（枝角目，甲壳纲）的活动抑制试验-急性毒性试验（WaterQuality-OECD化学品测试导则No.23难测试化学品水相水生毒性试验指导文件（GuidanceDocumentonAqueous-PhaseAquaticToxicityTestingofDifficultTestChemicalinTheStatisticalAnalysisofEcotoxicityData:AGuOECD化学品测试导则No.112水中的解离常数（DissociationConstantsinOECD化学品测试导则No.236鱼类胚胎急性毒性试验（FishEmbryoAcuteToxicit2一种能与激动剂配体结合，并阻断或抑制该配体介导反应的化雌激素活性estrogenicac受试物模拟17β-雌二醇作用的能力，以雌激素受体特异性的方式激活内源性cyp19a1b和/或由用于表明实验室具有标准化测试技术能力的一系3否能正确测定或预测所关注的生物学效应及其准确性。相关性考虑了通过试验正确分类得到的所有阴性/非活性化学物质的比例，用于衡量产生分类结果的试验方法的Dpf：受精后天数（Daypost-fertilizatDMSO：二甲基亚砜（DimethylSulfoxiEE2：17α-乙炔雌二醇（17α-ethinylestraE2：17β-雌二醇（17β-estraER：雌激素受体（EstrogenRecepERE：雌激素反应元件（EstrogenResponseElGFP：绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProHpf：受精后的小时数（HourspostfertilizatioROI：感光区域（RegionofInte4实验室应定期开展能力确认试验，以验证转基因胚胎的响应性。每年用EE2或E2进行一次正式56.2×103.75×102.48×108.4×104×107.39×104.6×10 ））6转基因纯合子tg（cyp19a1b：GFP）品系的培养条件与野生型斑马鱼相同。转基因成鱼定期内交以鱼与野生型斑马鱼进行一次异交。通过观察携带该转基因的后代中GFP的组成性表达，选择转基因胚胎采用未经化学品暴露的转基因斑马鱼获取鱼卵。亲鱼在产卵前2个月不得接受任何药物（急性或预h，推荐承载量为1尾鱼/1L。将亲鱼饲养在活性炭过滤水通过亲鱼在大型水箱中集群产卵的方式采集转基因斑马鱼卵。持续将60到100尾转基因成年雄鱼和虫)无节幼体与适当大小的溞类。提供活食有利于环境丰容，因此应尽可能提供活食。在试验前一天，利用双目显微镜，选择发育正常的受精卵，转移到玻璃容器中，承载量为1个胚胎/使用合适的试验用水，如重组水（ISO6341）或水质良好的地表水/井水。试验前对试验用水进行S/cm温度（27℃±2℃)。7暴露容器置于人工气候培养箱中，温度为27℃±2℃,控制光周期（12h~16h光照：12h~8h如缺乏受试物相关急性毒性数据，应对斑马鱼tg（cyp19a1b：GFP）胚胎开展照只设置一个包含10个胚胎的平行。预试验中每个暴露容器含有258验溶液之前（24h±2h）测定其中一个平行，在暴露期间至少测定一次。受试物的稳定性应在24h内保持在理论浓度的±20%范围内。可在试验开始前用试验溶液预处理试验容器至少24h，以尽量减少吸果，胚胎观察可参考OECDNo.236导则。孵化速率的延迟会减少鱼类在受试物中的暴露，可限制EASZY一个24孔的荧光载玻片可以转移同一浓度组的所有胚胎。此时可以麻醉胚胎管顶端重新定位胚胎，从背侧观察胚胎，过程中可以使用固定介质（如甲基纤维素)。在该发育阶段，99数据分析和结果评价对每个胚胎进行图像分析后，将结果记录在数据表中。对斑马鱼个体荧光的定量以转基因tg为了确定某种化学物质的潜在活性，通过方差分析（ANONA）对浓度组和对照组各个平行的效值进行比较。应对空白对照和溶剂对组（如有）之间的GFP采用适当的统计方法进行分析,可参考OECD），如浓度-效应关系接近单调时,可用非参数统计方法如Jonckheere-Terpstra检验或Williams检验，分析统计流程图见附录I。其他更多关于生态毒性数据统计的分析方如果有活性则表明其为雌激素。这有助于避免EASZY试验中潜在的假前期的验证试验结果为EASZY试验方法的可靠性、准确性和稳定性提供了依据，它表明受试物的雌c)试验结束时，空白对照组和溶剂对照组（如有）；）；——应根据有效性和判定标准来解释受试物的潜在雌激素活性，并对结果进行讨论；——如果试验浓度的数量允许建立完整的浓度-效应曲线，可推导引起最大效应50%的浓度AI）和20bp的未翻译外显子II（exonII后面是天然翻译起始位点。将含有SV40polyA序列的GFP根据受试物诱导GFP表达（受斑马鱼雌激素受体调控cyp19a1b启动子驱动）的能力来揭示该化学品固醇生成途径转化为已知的具有雌激素活性的DHT代谢物5α-雄甾烷-3β和17β-二醇(β-二醇）。一系列天然与合成激素以及属于不同化学家族的化学品诱导GFP的能力，已经在转基因tg实验室间比对验证试验表明，化合物作为激动剂直接与雌激素受体结合，通过特（ER-specific）的方式诱导了GFP。EASZY试验可以测定和分辨从低浓度（ng/L）到也不涉及雄激素应答元件，而是由于睾酮和甲基睾酮分别芳香化为雌二醇（estradiol）和甲雌二醇雌激素受体非雄激素受体存在的情况下。相反，另一种非芳香化雄激素11酮-睾酮（11C.2使用助溶剂时试验溶液的详细制D.196h暴露后载有转基因斑马鱼），图E.1不同GFP表达水平的存活转基因tg（cyp19a1b：G图E.2暴露于溶剂DMSO和14.8nh强度应恒定。可以在一系列测定的前后使用荧光校分析工作已经完全自动化，以实现在短时间内分析大量的图像。这些图像分析通过一个免费的专门为图像分析的一个关键标准是灰度阈值。灰度阈值对应一个能使报告荧光蛋白产生的荧光与鱼体的自体荧光（背景荧光）区分开的灰度值。为了确定这个参数，需建立以下程序。灰度阈值一旦确定，将只分析灰度高于阈值的像素。这个阈值对于每台荧光显微镜设备都是不随时间改变，但当荧光设备发生变化时，如安装一个新的光源时，灰度阈值可能会改变。使用EASZY_FAST宏所需的软件有：a)ImageJ1.53或更高版本：https：///Download或https：///Fijic)Bio-Formats6.6.1或更高版本：/bio-formats/（用于读写生命科学图像文件格式的库）G.2.2“EASZY_FAST”宏的图a)步骤1：批处理所选目录——应用用户定义的阈值（默认值为290），然后分析该阈值以上的片段；——将一个ROI中高于阈值的像素分组，并将该ROI保存在image目录中的.zip文件中。b)步骤2：查看选定的ROI并测定——逐个打开图像，查看自动选择的ROI；——用户可以确认ROI，在进一步的分析中直接修改它或删除图像。启动ImageJ工具栏中的宏：插件（Plugins）\快速（Fast）\快速分析（FAST_Analyze）宏会提示选择包含图像文件的目录。所选目录和所有子目录将被进行分析处该宏将显示一个对话框，以设置分析选项：阈值（Thresholdvalue为像素强度设置较低置阈值。文件类型（Filetype）：在CZI，ZVI（蔡司视觉之后将显示一个对话框（ROIcheck）来验证ROI。手动（默认）或宏工具窗口中列出所有带有文件名的测定图像。该表可以自动保存为启动时选择的工作目录中H.1由比对试验获得的溶剂、试验用水和阳性对照中GFP测每个实验室都报告了溶剂、试验用水和与阳性对照（14.8ng/LEE2）的统计能力依然很高，能够反映其检验对照组和试验组之间差异的试验2试验2试验2试验2RawIntDen=胚胎荧光强度（基于图像分析；见GFP（fold）=……（H.1）存活率（%）=在受精9活胚数×100……（H.2）孵化率（%）=在数×100………………（H.3）表H.2从EASZY试验中收集的数据示例n117234567216234563162345611723456721723456731623456117234567217234567317234567表H.2从EASZY试验中收集的数据示例（续）11723456721723456731723456711723456721723456731723456711723456721623456317234567表H.2从EASZY试验中收集的数据示例（续）1172345672172345