转基因植物核酸标准物质的研制

1本规范规定了转基因植物核酸标准物质研制策划、制备、均匀性评估、稳定性评估、互换性评估、定值、不确定度评定、研制报告和证书、包装和保存等要求，适用于JJF1342标准物质研制(生产)机构通用要求GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB8170数值修约规则与极限数值的表示和判定NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T1101转基因植物及其产品食用安全性评价导则《农业转基因生物安全管理条例》(中华人民共和国国务院令第304号)全国科学技术名词审定委员会.遗传学名词凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。通过基因工程技术改变基因组构成的植物。3.3转基因植物核酸标准物质geneticallymodifiedplantnucleic具有足够均匀和稳定的特性，用于转基因植物核酸成分测量程序校准、确认与质量23以转基因植物提取的基因组制成的物质，为转基因植物基因组标准物质(genetically3.4质粒plasmid细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。3.5基因组genome一种生物体具有的所有遗传信息的总和。在聚合作用的起始时，可以引发合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的寡核苷酸序列。3.7内源参考基因endogenousreferencegene在生物体自身基因组内，具有恒定拷贝数，不发生等位基因变异的特定序列基因，可用于分析目标生物体基因组和基因表达。3.8外源基因exogenousgene经过转基因步骤导入受体细胞的基因。【全国科学技术名词审定委员会.遗传学名词03.122】plasmidreferencemat转基因质粒标准物质的属性，是指利用转基因质粒标准物质和转基因植物基体标准物质进行聚合酶链式反应扩增时的扩增效率、所产生标准曲线的截距和线性相关系数的一致性。4通用性原则4.1应遵照JJF1342、JJF1343对标准物质研制的相关要求。4.2转基因植物核酸标准物质的研制场所、操作活动、废物处理等应该遵照国家法规、标准、国际公约、转基因生物安全管理等的相关要求。35.1标准物质研制机构承担转基因植物核酸标准物质研制(生产)项目的策划和管理。5.2转基因植物核酸标准物质的类型和不确定度水平应适用于其在不同转化体转基因植物及其产品核酸检测中的预期用途，包括测量程序校准、确认、质量控制以及转基因5.3根据进出口贸易、市场监管、生物安全评估等需要进行转基因植物核酸标准物质5.4评估转基因植物核酸标准物质候选物或原料的可获得性，并说明候选物的转基因5.5评估转基因植物核酸标准物质定值方法的计量溯源性。5.6评估转基因植物核酸标准物质均匀性、稳定性、互换性等方法的适用性满足标准6.1.1候选物材料来源应清楚，信息完整，包括典型性、转化体纯度、转化体纯合度、重组质粒中的转化体特异性外源基因序列、转基因生物安全管理和登记信息等。当国际公约、国家法规有规定时，应说明转基因植物核酸标准物质的候选物来源的合法性。6.1.2候选物的选择应满足适用性、代表性，以及容易复制的原则。候选物应有足够6.1.3候选物的鉴定应科学合理，根据标准物质的不同类型进行鉴定。如农作物转基因植物基体标准物质候选物的鉴定应包括典型性鉴定、转化体纯度、转化体纯合度等，可参照GB/T3543.5分别确定转基因植物候选物中插入的外源基因的真实性、遗传背景和纯度，其中候选物的外源基因和内源参考基因等位基因的检测纯度均应大于99.9%。6.2.1制备的转基因植物核酸标准物质应与实际分析样品的基体尽可能保持一致，适6.2.2转基因质粒和基因组标准物质纯度应满足吸光值A₂o/A₂so值介于1.8～1.9之间，A₂so/A₂so值大于2.0。6.2.4包装应满足该标准物质的预期用途。一7.1JJF1343对标准物质均匀性评估的要求适用于转基因植物核酸标准物质。47.2.1应根据转基因植物核酸标准物质的类型、状态等制定均匀性评估方案，选择不7.2.2转基因植物基体标准物质：可采用聚合酶链式反应方法评估外源基因与内源参考基因拷贝数比值的均匀性，也可采用可靠的间接方法评估转7.2.3转基因质粒标准物质：外源基因拷贝数、内源参考基因拷贝数以及两者比值的7.2.4转基因植物基因组标准物质：同7.2.2。JJF1343对标准物质稳定性评估的9.1评估原则9.1.1研制转基因质粒标准物质时，应评估其与转基因植物基体标准物质或基因组标9.1.2进行互换性评估前应设计互换性评估方案。参与互换性验证的实验室不少于3家。9.1.3内源参考基因和外源基因应同时满足互换性要求。互换性仅存在于特定转化体9.1.4应在相同的条件下测量特定转化体的基因组和质粒标准物质，通过数学相关性a)应明确参加实验室个数、实验室资质、测量方法、基因组来源、统计方法、原b)应优先选用转基因植物基体有证标准物质获得基因组，在此类有证标准物质无法获得时可选择经确定为该品系的转基因植物组织如叶片来获得基因组。c)在进行互换性评估时，基因组和待评估的质粒标准物质浓度不少于5个水平，基因组的浓度范围需与待评估质粒标准物质的浓度范围相同或相近。包括扩增效率，标准曲线的线性拟合度、截距分析等。转基因基体标准物质的特性值是指转基因植物组织粉末与非转基因植物组织粉末的质量分数和转基因外源基因与内源参考基因拷贝数比值。a)单一实验室采用基准方法重量法确定转基因植物组织粉末与非转基因植物组织b)使用聚合酶链式反应方法，由多个实验室合作定值，如数字PCR或荧光定量PCR方法。若采用2种方法多家合作定值，应由不少于6个实验室参与定值；若采用1种方法合作定值，应由不少于8个实验室参与定值。10.2转基因质粒标准物质和转基因植物基因组标准物质的定值10.2.1转基因质粒和转基因植物基因组标准物质的特性值转基因质粒和基因组标准物质的特性值应包括外源基因与内源参考基因拷贝数比值10.2.2转基因质粒和基因组标准物质定值方式的选择a)由单一实验室采用两种可溯源的绝对方法，如数字PCR方法和测序方法两种方法确定转基因质粒和基因组标准物质外源基因与内源参考基因拷贝数比值；采用同位素稀释质谱方法和数字PCR方法确定转基因质粒和b)使用一种方法，应由不少于8个实验室合作定值。10.3.1由单一实验室完成定值的，该实验室应定期参加国际计量比对并取得国际等10.3.2采用合作定值方式时，应通过组织计量比对、能力验证、测量审核等方式筛选a)主导实验室与参与定值实验室签订定值合同，合同中应包括质量控制要求和b)根据定值合同的要求实施测量活动，包括测量的单元数、重复次数等。d)保证每次测量的独立性，如不同的操作人员、不同测量时间、不同的实验装e)应记录所有与标准物质定值相关的重要活动和数据f)按照JJF1059.1的原则识别、控制不确定度来源，并在需要时评定测量不确定值数据审核、数据评估和统计处理应按JJF1343、JJF1059.1的标准物质的定值结果及不确定度应由研制机构按照JJF1343、JJF1059.1进行评定11.1.1应依据JJF1218的要求以及标准物质管理部门的规定，编制转基因植物核酸6标准物质研制报告。11.1.2研制报告应描述标准物质的研制策划、转基因候选物来源、制备、均匀性评估、稳定性评估、互换性评估、定值、方法确认及溯源性、不确定度评定、包装和保存等信息，并提供充分的数据及分析信息，按JJF1059.1和GB8170对数据进行修约。11.2证书和标签标准物质证书的编写和标签的内容应符合JJF1186的要求标准物质应按照长期稳定性保存条件储存，保证在有效期内维持其性能参数。7A.1互换性评估互换性评估是对转基因质粒和基体或基因组的PCR扩增斜率、标准曲线的截距和线性相关系数的一致性进行分析，两者的PCR扩增效率、截距和线性相关系数偏差越大，说明转基因质粒标准物质的互换性越差。A.2实验设计选择不少于3家实验室使用荧光定量PCR方法进行转基因玉米NK603质粒和基因组的互换性研究。分别对质粒和基因组进行5倍稀释，稀释5个浓度。参加互换性评估的实验室提交3次测定所得到的PCR扩增效率、标准曲线的线性拟合度(R²)和截距，以及测定结果的原始数据(PCR扩增Ct值),格式见表A.1和表A.2。次数内源参考基因Ct(设置3个平行)外源基因Ct(设置3个平行)1231231234512345123458次数内源参考基因Ct(设置3个平行)外源基因Ct(设置3个平行)123123123451234512345A.3数据处理首先以扩增得到的Ct值作为Y,相对应的DNA浓度的对数作为X,进行线性拟合，得到Y=aX+b的线性方程，其中a为直线的斜率，b为直线的截距。然后将直线的斜率根据公式(A.1)换算成PCR扩增效率。将各家实验室的扩增效率E、截距、线性拟合度R²按照表A.3～表A.5整理。A.4互换性结果评价采用F检验对表A.3～表A.5中的数据进行统计分析。在95%的包含区间内，取a=0.05,计算临界p值。若计算得到的p>0.05,即在F分布的95%的包含区间内，认为两组数据没有差别。若计算得到的p<0.05,认为两组数据有显著性差别。通过分析3家实验数据，分别对基因组和质粒的扩增效率、线性拟合度和截距进行互换性的评价，如果基因组和质粒的扩增效率、截距和线性拟合度均无显著差异，则二者之间可以实现互换；反之，则质粒与基因组无法实现互换。9表A.3PCR扩增效率统计结果(基因组n=9,质粒n=9)测量外源基因扩增效率/%表A.4标准曲线R²统计结果(基因组n=9,质粒n=9)测量外源基因R²内源参考基因R²表A.5标准曲线截距统计结果(基因组n=9,质粒n=9)次数外源基因截距内源参考基因截距表A.5(续)次数外