生物医学科研：研究方法

生物医学科研

──基本知识和技能第三章

生物医学研究方法现代医学科学研究特点一是研究更为深入，利用现代生物学先进技术，在核酸、蛋白质等生物大分子水平上阐述生命体的结构和功能特征，并且利用基因技术使人们能够设计和改变生物体特征。现代医学科学研究特点二是研究技术的综合应用，以往各学科单一的研究方法系统正在被跨学科多水平的实验体系所取代，高水准的研究一般都在整体、离体组织、细胞、分子多种水平上证实一种论点。现代医学科学研究特点三是高新技术的采用，使得无损伤非侵入式研究越来越广泛采用，不仅可以在实验动物上得出与人更接近的结果，还能直接用于人体的研究。一、研究方法的类型和选用原则（一）不同层次的研究方法1、分子水平2、细胞水平3、组织或器官水平4、整体水平5、人体研究一、研究方法的类型和选用原则（二）不同学科的研究方法1、生理学方法2、生化学方法3、形态学方法4、免疫学方法5、药理学方法一、研究方法的类型和选用原则6、计算机技术（1）讯号分析（2）图像分析（3）动态测量和遥测（4）信息贮存、处理和共享bioinformatics一、研究方法的类型和选用原则7、生物物理学方法生物物理学方法在生物分子理化特点阐明、大分子立体构型测定、各种药物分子设计等方面发挥了积极作用。现代结构生物学（structuralbiology）的兴起。一、研究方法的类型和选用原则（三）研究方法的选择原则①功能的表现形式，如物理现象（电活动、机械力等）、化学现象（物质、能量改变及其调控方式）、形态学特点（宏观和微观的改变、空间定位等）、行为学改变（如学习记忆、自发活动等）。②生物分子的定性、定量、定位，时间过程，与功能的联系。根据这些考虑，来合理组织方法，从不同水平和不同侧面阐明和解决一个问题。③采用干预手段如基因的knock-in,knock-down,knock-out，或应用各种工具药、抗体等影响分子及功能。一、研究方法的类型和选用原则1、能够完成研究目标无疑，选择的研究方法应当能够解决研究目标中提出的问题。例如，研究目标是探索A因子对脑缺血的调节作用，选择的方法就应当能够检测A因子量及活性的改变；还应选择不同的脑缺血动物模型；这些方法要满足各个具体实施阶段和观察指标的要求。一、研究方法的类型和选用原则2、能够从几个角度说明一个问题单一的方法往往不能揭示问题的全貌，因而现代生物医学研究中常常需要几种类型方法的组合，从不同侧面阐明问题的特征。A.胚胎干细胞水平进行分子操作诱导型CaMKII基因敲除分子功能的研究策略B.海马脑片电生理试验长时程增强C.学习记忆行为学试验Morris水迷宫一、研究方法的类型和选用原则3、根据现有条件研究者常常困扰于研究手段的不够，解决的办法可以是利用其他研究设施，也可以充分利用本单位现有研究设施和条件，显然，后者更可行。在确定研究目标时就应当充分考虑结合现有研究条件，尽可能充分利用本单位的特色和优势来设计研究方案。二、几类发展较快的研究方法1、功能可视化2、高通量筛选3、生物信息学二、几类发展较快的研究方法1、功能可视化细胞水平：

①Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cl－等离子，cAMP、细胞内pH、膜电位、钙调蛋白、PKC等的变化②荧光蛋白基因标记目的蛋白整体水平：化学发光、fMRI、PET等PhotographofthejellyfishAequorea

victoriawhichproducesthegreenfluorescentprotein

(GFP).(PhotographcourtesyofClaudiaMillsattheFridayHarborResearchLaboratories,WA,USA.)KainSRGreenfluorescentprotein(GFP):applicationsincell-basedassaysfordrugdiscovery.DrugDiscovToday1999;4(7):304-312.荧光信号检测肿瘤或器官肿瘤不同器官磁共振（MRI）检测脑病理变化及肿瘤分子变化（活体显微镜）正电子发射断层扫描（PET）检测分子变化功能磁共振（fMRI）检测功能变化2、高通量筛选

（high-throughputscreening,HTS）以玻璃片、膜片或培养板为载体，用高密度、微量自动化加样的方法，实现短时间内分析大量样本，这就是最近发展起来的高通量筛选方法。二、几类发展较快的研究方法DNA、蛋白等芯片技术一次可测定数千至上万个点。细胞水平高通量筛选方法通常一次可以测定384～1536个点，现在还有3456个点的超高通量筛选方法（ultra-high-throughputscreening,UHTS）。二、几类发展较快的研究方法Computer-generatedvisualizationoftheUHTSSconfiguration(AuroraBiosciences,SanDiego,CA,USA).Thesystemisdesignedtointegrateaworkingcompoundsolutionstore,96-or384-wellplatereplicatingsystem,componentsforautomateddistributionofcompoundsandassayreagentsintohighdensity3456-wellNanoWellassayplates(AuroraBiosciences),automatedincubatorsandahigh-performancefluorescenceplate-reader.TheHitProfilingRobotprovidesautomatedre-formattingofselectedcompoundsforre-testing.（1）高通量筛选的基本条件①基因/蛋白库，筛选疾病基因或其表达的蛋白，需要有完备的基因或蛋白库。②检测指标，需要将检测指标转化为有简便、灵敏、稳定的客观检测信号，如荧光、化学发光、放射性核素等。③检测仪器，制作快速检测微量样本的仪器，保证高通量筛选的信息能够快速准确地读出。二、几类发展较快的研究方法④自动化取样和加样机器人，一次加样上千个微量样本，人工无法完成，因此研制自动化仪器同样是必不可少的条件。⑤计算机数据分析系统，针对短时间获得的庞大的实验数据，必须有相应的计算机硬件和软件的支持。⑥化合物库，高通量筛选药物还需要有数十万至上百万个化合物储备。二、几类发展较快的研究方法高通量筛选涉及到医学及其各个分支、分子生物学、化学、光学、自动化仪器、计算机等众多学科。二、几类发展较快的研究方法（2）用于高通量筛选的生物材料

一类是cDNA、寡核苷酸、mRNA、抗体、酶、蛋白等生物大分子，将生物大分子以高密度微矩阵方式排列于玻璃板或膜片上，与生物样本反应，然后检测观察指标的变化，常称为芯片（chip）技术。一类是细胞。以细胞为材料的研究方法，采取预先制备目的基因或报告基因的转染细胞株，然后观察目的基因或报告基因表达变化。二、几类发展较快的研究方法（3）研究方法类型预先将不同样本（不同处理方式、不同处理时间、不同个体等）排列在载体上，然后与相同的探针反应，检测指标变化。预先将不同探针排列在载体上，然后与相同的生物样本反应，检测指标变化。二、几类发展较快的研究方法DNA芯片（基因芯片）研究结果基因表达谱研究AD病人基因组功能异常红色：表达增加蓝色：表达减少蛋白芯片研究方法示意图2D蛋白电泳示意图2D蛋白电泳显示蛋白表达谱及其结果解析需要指出的是，高通量技术的采用并不排除传统研究方法，而是互相补充。高通量技术快速检出相关的靶分子，再以精细的方法深入研究靶分子变化特点，或在整体或离体水平观察其功能变化特点。在传统研究方法中引入高通量技术，将大大促进传统技术的改进和研究效率的提高。二、几类发展较快的研究方法3、生物信息学（Bioinformatics）“insilico”研究近年来提出一类新的研究技术，即insilico研究技术，字面是解释是“硅片上的研究”，即利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究。该技术指的是利用生物信息学技术将获得的实验数据与生物信息数据库进行比对、分析和评定，获取研究结论的研究技术，与invivo、invitro、insitu、exvivo等技术相平行。insi