DNA复制概述课件

第5章DNA复制

(Chapter4DNAReplication)

1DNA复制概述Chapter4DNAReplication（DNA复制）5.1DNAReplication:AnOverview5.2EnzymologyofDNAReplication5.3BacterialDNAreplication5.4EukaryoticDNAreplication5.5Regulation0fDNAreplicationMolecularBiologyCourse2DNA复制概述

第一节DNA复制概述

(DNAReplication:AnOverview)

一、基本概念二、DNA的半保留复制三、复制起点、方式和方向四、DNA复制的半不连续性DNA复制概述一、基本概念DNA复制

亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。

4DNA复制概述复制子(Replicon，复制单位或复制元)

DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator复制子的长度大小不均，1.3万—90万bp不等。5DNA复制概述在真核生物中，染色体为DNA分子的载体，每条染色体含一个DNA分子。每个DNA分子上含多个复制子。一条染色体上的多数复制子在细胞周期的S期中，在ATP存在下只复制一次。6DNA复制概述mammaliancell

500-5000bp/min

E.coli，37℃,0.5h,105bp/minDNA复制在细胞周期的S期7DNA复制概述二、DNA的半保留复制

（Semi-ConservationReplication）概念：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子。8DNA复制概述理论上DNA的复制也可采用其它方式，如另一种叫全保留复制(conservativereplication)的复制方式也是可能的，在这个模型中两条DNA亲代链保留在一起作为子链合成的模板(图6-1)。9DNA复制概述DNA复制的两种模型那么，那一种复制方式更为真实呢？10DNA复制概述Semi-conservativemechanismwasdemonstratedexperimentallyin1958by

MeselsonandStahl--------Proof1

1958Meselson-stahl设计的CsCl超离心试验证实了DNA复制的这一特性。11DNA复制概述CsCl(Cesiumchloride)densitygradientultracentrifugation（CsCl密度梯度超离心）LabeledE.ColiDNAwith15N14NDNAreplication12DNA复制概述提取DNA，CsCl密度梯度离心细菌在有15N-标记的培养基上生长多代，使DNA双链充分标记转入14N后立即取出繁殖一代后取出繁殖二代后取出13DNA复制概述DNAreplicationE.ColiDNA在15N-标记的营养液中生长多代，使DNA双链充分标记万有引力将15N-标记的E.Coli

加入14N培养液中细胞在14N中复制1次细胞在14N中复制第2次细胞在14N中复制第3次14DNA复制概述DNAreplicationFigure:TheexpectedresultsoftwogenerationsofsemiconservativereplicationintheMeselson–Stahlexperiment.15DNA复制概述15N标记实验·细胞生长在15N标记培养基中·转入正常N源培养基中·分离各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N标记DNA未标记DNACsCL密度梯度离心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml16DNA复制概述17DNA复制概述

三、复制起点、方向和方式1、复制起点（origin，ori或O，复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即——整个染色体只有一个复制单位18DNA复制概述AllprokaryoticchromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecirclesandcomprise

singlereplications.

（单复制子）19DNA复制概述真核生物（Eukaryote）:多复制起点，即－－一个genome中有多个复制单位20DNA复制概述ATrich富含AT&发夹结构“呼吸作用”十分明显，许多酶的结合位点真核生物的复制原点约300bp±复制起点序列特征21DNA复制概述2、复制方向（复制过程的顺序性）复制叉（Replicationfork）：复制时DNA分子中的“Y”形区域，是由解开的两条链和尚未松解开的双螺旋形成的。在复制叉区域发生双链的不断分离和新链的合成,代表DNA复制中的生长点。复制叉从起始点起沿着DNA合成方向连续向前移动。无论原核或真核细胞，在电镜下均可看到此种复制现象。DNA复制概述Replicationfork23DNA复制概述复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛。24DNA复制概述真核生物的多复制子多个复制眼DNA复制概述ElectronMicroscopyofreplicatingDNArevealsreplicatingbubbles.DNA复制概述

单向复制

双向复制（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉27DNA复制概述单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向(原核)多起点、双方向（真核）（2）复制的多模式28DNA复制概述3、复制方式（1）从新起始（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）或θ型（2）置换式（Displacementform）又称D环复制

（3）共价延伸方式（covalence

elongation）或滚环式复制（rollingcirclereplication）29DNA复制概述DNA复制方式θ型（西塔型）线性DNA双链的复制D-环型滚环型30DNA复制概述

（1）从新起始（denovoinitiation）或复制

叉式（replicationfork）或θ

复制AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.31DNA复制概述双向复制

单、双向θ

复制模式图单向复制32DNA复制概述线粒体和叶绿体DNA的复制方式两条链上的复制起点不对应时产生D-环复制。（2）置换式

Displacementform

又称D环复制

33DNA复制概述由于复制时产生的滚环结构形状象σ(sigma)，又称σ复制病毒、细菌因子（3）共价延伸方式

（covalence

elongation）或

滚环式复制

（rollingcircle

replication）DNA复制概述双螺旋环状亲代DNA序列特异性内切酶在复制起点产生一个缺口环状模板链继续伴随3’-OH的共价延伸而“滚动”。单链子代DNA经切割和重新闭合成环而产生滚环式复制

（σ复制）5’-P末端被取代，向3’-OH共价延伸。35DNA复制概述四、DNA复制的半不连续性

（Semi-DiscontinuousReplication）

36DNA复制概述3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘合成方向的问题：DNA聚合酶只能以5'→3'方向合成DNA，事实上没有发现DNA能按3‘→5’合成的证据37DNA复制概述E.coli[t-]2’’,7’’,15’’,30’’

脉冲标记dT-H3

0℃KCN杀死D.S.DNAS.S.DNA密度梯度离心测定H3-T放射强度脉冲追踪20℃indT-H330’’正常培养基中数分钟

冈崎片段（Okazakifragment）1968

D.S.DNA38DNA复制概述H3-T脉冲追踪

脉冲标记30’’15’’7’’2’’10S(1kb)40S(Prok.850Nt/sec)新合成的都是1Kb左右的冈崎片段？两条链都是不连续合成的？？？？39DNA复制概述---A-------T-------A-------T--------G--------C----dUTP

:dTTP=1：300／cell

AUGUdutgenedUTPaseDNA中不能有U?突变频率=

1/1200！

半不连续复制的证据

DNA内的dump片段的存在---U------

------A---

---A---

Ungase

ung尿嘧啶-N-糖基酶U少数dUTP

DNA复制概述UUdenaturedumpfragment~1200base~OkazakifragmentAA41DNA复制概述

以下实验证实了这个解释(1)在dut-突变体（dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut+中为短。这是因为U掺入机会增加；(2)在ung-（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中新合成的DNA约有一半由片段组成。这是因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。

42DNA复制概述前导链

(dUMP片段长度)

后随链（冈崎片段的长度）

dUMP片段脉冲追踪

脉冲标记30’’15’’7’’2’’Okazaki片段在某种意义上为

dUMP

片段DNA复制概述

先导链(leadingstrand):DNA复制时，与复制叉向前移动的方向一致，以3’→5’链为模板，按5’→3’方向连续合成的一条链。先导链按

dUMP片段连续复制后随链（laggingstrand）：按Okazaki片段不连续复制冈崎片段(Okazakifragment):DNA复制不连续合成链中形成的短DNA片段。44DNA复制概述45DNA复制概述第二节DNA复制的酶学

EnzymologyofDNAReplication复习：DNA复制

亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。

46DNA复制概述DNA复制的体系底物：

dNTP(dATPdGTPdCTPdTTP)聚合酶（polymerase):DNA-pol

依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP)模板（template):

解开成单链的DNA母链引物（primer):寡核苷酸片段,提供3’-OH末端,使dNTP聚合其它酶和蛋白质因子:

解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶等47DNA复制概述第二节DNA复制的酶学

(EnzymologyofDNAReplication)重点一、DNA聚合酶二、DNA连接酶三、与DNA几何学性质相关的酶

48DNA复制概述一、DNA聚合酶DNA聚合酶是催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均缩写为DDDP。49DNA复制概述(一)DNA聚合酶催化的反应5´→3´的聚合活性5´→3´外切酶活性3´→5´外切酶活性50DNA复制概述1、5´至3´的聚合活性聚合反应的特点：(1)以单链DNA为模板(2)以dNTP为原料(3)引物或DNA链提供3´-OH(4)聚合方向为5´→3´催化四种dNTP以磷酸二酯键一个一个地接到DNA链上去

(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi51DNA复制概述hydroxylgroupat3’endofgrowingchain52DNA复制概述deoxynucleotidetriphosphatehydroxylgroupat3’endofgrowingchain53DNA复制概述Pyrophosphate焦磷酸酯(PPi)thisbecomesnew3’endnewphosphodiesterbond54DNA复制概述2、

3’－5’

外切核酸酶活性

校对功能(proofreading)DNApolⅠ,Ⅱ和DNApolⅢ都具有3’→5’外切酶活性，DNApolⅡ是主要的修复酶。55DNA复制概述PPPPPPPPPPTTAAAAGGCCHOPGPCOHGPOHUPOHUPOHGPOHOHAPPPOHAPOHPPPOHCPOHCPPPOHCPOHClops!5'5'3'RNAprimerOHPOHCDNApolymerase(5‘→3'polymerase)(3'→5'exonuclease)lop56DNA复制概述3、5’－3’外切核酸酶活性DNApolⅠ独有的5’→3’外切活性有以下三个特点：必须有5’－磷酸末端被除去的核苷酸必须是已经配对的被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移）57DNA复制概述PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPTUTTTAAAAAGGGGGCCCCCHOAPOHOHOHOHOHUOHOHOHnewDNARNAprimerDNApolymerase(5'→3'exonuclease)APOHOHAPOHOHAPOHOHAPOHOHAPOHOHAPOHOH5'5'3'3'58DNA复制概述DNA聚合酶I的切口平移反应（Nicktranslation)59DNA复制概述1957ArthurKornberg首次发现Infact,thereare5polymerasestodate,althoughwewillfocusonlyon3DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ(二)原核生物的DNA聚合酶（E.coli）60DNA复制概述1.DNAPolymeraseIDNA聚合酶I由一条肽链组成，含三种酶活性，蛋白水解酶subtilisin酶解后得到的大片段部分为Klenowfragment，拥有两个酶活性，去掉了5’→3’外切酶活性。5’

3’exo3’

5’exoPolymerase-CN-36kD67kD(Klenowfragment)NormallyDNApolIcontainsall3domains61DNA复制概述DNApolⅡ：5`→3`聚合酶活性及3`→5`外切核酸酶活性。DNApolⅢ:由10种亚基(αβγδδ’

εθτχψ)组成不对称异源二聚体。核心酶（αεθ）2.DNAPolymeraseⅡ和Ⅲ62DNA复制概述DNApolⅢ63DNA复制概述DNApolⅢ各亚基的功能α亚基：5′→3′聚合酶活性β亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动γ－复合物（γ、δ、δ’、χ、ψ、τ）：促进全酶组装至模板及增强核心酶活性ε亚基：3′→5′外切酶活性和碱基选择功能，是复制保真性所必需θ亚基:

可能起组装作用

64DNA复制概述

亚基形成一个围绕DNA的环状钳twohalvesofslidingclampclampedpolymerasetetheredonDNA65DNA复制概述66DNA复制概述3.三种大肠杆菌DNA聚合酶特性之比较

特性聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ起始新链合成———５’→３’核酸聚合酶+++聚合速度(核苷酸数/酶分子·分)1000-1200240015000-60000３’→５’核酸聚合酶———３’→５’核酸外切酶+++５’→３’核酸外切酶+——分子量1030090000167500每个细胞分子数400100？1567DNA复制概述三种大肠杆菌DNA聚合酶的

主要功能DNApolⅠ----主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复。DNApolⅡ----是主要的修复酶DNApolⅢ----是主要的复制酶68DNA复制概述三种DNA聚合酶在决定DNA合成

方面的共同特性①三种酶都只有５’→３’聚合酶的功能，而没有３’→５’聚合酶功能，说明DNA链的延伸只能从5’向3’端进行。②它们都没有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下进行链的延伸，因此，DNA的合成必须有引物引导才能进行。③三种酶都有核酸外切酶的功能，可对合成过程中发生的错误进行校正，而保证DNA复制的高度准确性。69DNA复制概述已知的DNA聚合酶只能使链按5’－3’方向生长5’OHTCATCAC

5’OH3’pppOH

C++ppi进化中保留的深刻的选择与适应的化学及功能的根源为什么子链DNA延伸方向只能是5’

→3’70DNA复制概述

+ATCG

5’pppOH3’

G

pppOH

GATCG5’pppOH3’

如果DNA的延伸方向是3’→5’71DNA复制概述

+ATCG5’pppOH3’GpppOH5’pppGa、因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理环境中，使dNTP难以聚合到DNA的5’端

需要其他机制以解脱72DNA复制概述费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗

pppOHATCG+pppApOHTCGppp

OHTCG

ppp

OH

TCGb、碱基发生错配后的校正……73DNA复制概述（三）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

复制中延长随从链DNA-pol

没有其他pol时才起作用DNA-pol

催化线粒体DNA的复制DNA-pol

复制中延长领头链DNA-pol

校读、修复和填补缺口74DNA复制概述

─────────────────────DNA聚合酶性质

----------------------------------------------

α

β

γ

δ

ε─────────────────────分布

细胞核

细胞核

线粒体

细胞核

细胞核分子量(kd)>25036-38160-3001702563’

→5’外切酶活性

无

无

有

有

有5’

→3’聚合作用

有

有

有

有

有主要功能

复制

损伤修复

复制

复制

复制,损伤修复

(随从链)(领头链)─────────────────────表5-2真核细胞中DNA聚合酶的性质75DNA复制概述二、DNA连接酶（DNALigase）催化单链DNA切口上5’-P和3’-OH形成磷酸二酯键DNA复制概述所需条件：

a、切刻的3’－OH和5’－P相邻

b、切刻各自碱基处于配对状态

c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）用途：复制过程中，5’

端RNA引物被置换后切刻的连接，修复、重组77DNA复制概述ATPisanintegral主要

partoftheligationreaction—3’—OH—3’—O—3’—OH78DNA复制概述PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPTTTTTTAAAAAAGGGGGCCCCCHOOHOHPPDNAligase79DNA复制概述80DNA复制概述

三、与DNA几何学性质相关的酶81DNA复制概述解螺旋酶helicaseDNA拓扑异构酶DNAtopoisomerase单链DNA结合蛋白

SSB(singlestrandDNAbindingprotein)解开、理顺DNA链、维持DNA单链状态82DNA复制概述(一)解螺旋酶(helicase)模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供能，解开DNA双链。83DNA复制概述

复制相关蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX相应的表达产物蛋白质：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX

DnaA：辨认复制起始位点

DnaB：解螺旋酶

DnaC：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结合并打开双链。84DNA复制概述(二)DNA拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不