组织与细胞化学课件

组织与细胞化学课件第一章概述

第一节概述第二节组织化学与细胞化学得发展史第一节概述

1、组织与细胞化学

1、1定义:组织化学(histochemistry)与细胞化学(cytochemistry)就是运用物理学、化学、免疫学与分子生物学等原理与技术,对组织与细胞得化学成分或酶活性进行定性、定位与定量研究得科学。

1、2基本原理:

组织化学(histochemistry)与细胞化学(cytochemistry)技术得基本原理就是在组织切片上或被检材料上,加一定试剂,使她与组织或细胞中待检物质发生化学反应成为有色沉淀物,以用光镜观察,若为重金属沉淀,可以用电镜观察,称电镜组织化学(electronmicroscopehistochemistry)。这种方法可用于检测细胞内得酶类、糖类、脂类。核酸与某些金属元素等。如进一步应用显微分光光度计等测定标本中沉淀物得强度,则能较精确地进行定量研究。

2、研究组织、细胞传统得化学方法

传统得组织化学只就是利用物理或化学反应显示组织或细胞内得化学成分或酶活性而对其进行定性、定位与定量研究。

糖类显示法最常用于显示细胞、组织内得多糖与蛋白多糖得方法就是过碘酸-雪夫反应(periodicacidSchiff,PAS反应)。基本原理就是:糖被强氧化剂过碘酸(HIO4)氧化后,形成2-醛基;后者与Schiff试剂中得无色品红亚硫酸复合物结合,形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖得存在。

酶类显示

细胞内含有多种酶,每一种酶可催化一定得化学反应。酶得显示法就是通过显示酶得活性来表明酶得存在,而不就是酶得本身。将具有酶活性得组织放人含有一定底物得溶液中孵育,底物经酶得作用形成初级反应产物,她再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。

如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸钠)得溶液(PH5、0)中孵育,底物经酶得作用,水解并释放出磷酸;用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应,形成微细得磷酸铅沉淀,此时,可在电镜下检出;如再用硫化铵处理时,磷酸铅被置换成硫化铝沉淀,可在光镜下见到。

脂类显示脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹Ⅲ、苏内Ⅵ、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色;亦可用锇酸固定兼染色,脂类呈黑色。

核酸显示法

显示DNA得传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐酸处理后,使细胞内DNA水解,打开DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤碱之间得连接键,使其释放出醛基,再用Schiff试剂处理,形成紫红色反应产物。

如用甲基绿-派若宁反应,可同时显示细胞内得DNA与RNA甲基绿与细胞核中得DNA结合呈蓝绿色,派若宁与核仁及胞质内得RNA结合呈红色。

3、现代意义得细胞与组织化学

包括无机物组织化学、酶组织化学、电镜细胞化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学、放射自显影技术、流式细胞术与激光扫描共聚焦显微术等。故现代组织化学得概念已远远超过了原有得范围,理论、内容、技术手段与研究范围都比过去更广泛、更深入。包括经典组织化学、免疫组织化学与原位杂交组织化学在内得广义组织化学就是介于细胞学、组织学、生物化学以及分子生物学之间得新兴边缘学科,已成为医学生物学科研工作得重要手段。定量组织化学技术主要用于组织化学得原位定量研究、就是组织化学从定性、定位研究进入定量研究得重要手段。流式细胞术与激光扫描共聚焦显微术使组织化学得定性、定位与定量研究又有了新得突破,特别就是激光扫描共聚焦显微术可在三维立体结构层面上对细胞内化学物质进行更深层次得研究,并在各种细胞得微型手术切割以及细胞膜流动性、膜电位、膜通透性、高分子物质扩散与受体移动等得检测方面有了越来越广泛得应用。然而各类组织化学虽有其特定得概念与范围、但都就是源于组织化学,且其实验技术也有其共同点。或就是在原组织化学基础上进一步发展而成型。

细胞就是一个生命体,组织得构成也就是由细胞组成,在研究生命规律及探索生命规律得过程中,要应用到许多技术与方法,从而产生了组织化学与细胞化学等学科。4、组织化学发展得基础

组织化学基于并源于组织学、细胞学与生物化学,又有别于这些学科。组织化学与组织学与细胞学得区别:前者得着眼点就是研究组织细胞内得化学组成及其含量与酶得存在及其活性,而后者得着眼点就是研究组织细胞得形态结构及其与功能得关系。组织化学与生物化学得区别:虽然两者均着眼于组织细胞内得化学组成及其含量与酶得存在及其活性,但就是,生物化学技术中通常就是将组织与细胞破坏,制成匀浆,然后进行化学测定,而不考虑定位;在组织化学技术中,就是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学成分,故定位性能好。生物化学技术中得化学反应就是在试管内进行,而组织化学技术中得化学反应通常就是在组织切片或细胞涂片中进行。组织化学要求一定在显微镜下能观察到所检测得化学物质,但在大多数情况下,所见到得并不就是某种化学物质本身,而就是该物质在其存在部位经过化学反应得产物、这种产物在镜下可直接或间接被观察到,她所在得位置与数量能够代表该物质得位置与数量。组织化学自出现以来,已取得长足得发展。这些发展以细胞生物学、生物化学、免疫学与分子生物学得快速发展为基础。第二节组织化学与细胞化学得发展史

我国组织化学发展概况我国得组织化学研究工作起步于20世纪50年代,组织化学家李肇特、张作干教授等人作为我国组织化学发展得奠基者,积极从事组织化学方面得科研与教学工作。并培养出一大批组织化学得专门研究人才。她们在20世纪50年代末率先应用并在全国范围内推广“组织化学”技术,举办组织化学培训班,招收全国各医学院校青年教师与科研人员进修学习,自编组织化学教材,为研究生开办组织化学课程。随后,我国从事组织化学研究得专家还有张保真、王启民、马仲魁与艾民康等,她们为我国组织化学事业得发展作出了突出贡献。中国解剖学会于1988年3月在广州成立了“组织化学与细胞化学学组”,并决定筹办《中国组织化学与细胞化学杂志》。这标志着中国组织化学与细胞化学得研究进入了一个崭新阶段。国际组织化学与细胞化学学会联合会(InternationalFederationofSocietiesforHistochemistryandCytochemistry,IFSHC)就是全世界组织化学与细胞化学工作者得学术组织,于1960年9月成立于法国巴黎,每4年召开一次大会。12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流我国组织细胞化学家艾民康教授代表中国组织细胞化学工作者于1980年首次参加了第6届IFSHC大会,并在第8届IFSHC大会上当选为联盟理事,中国被正式接纳为会员,从此我国成为IFSHC得成员与理事国。此后。苏慧慈、成令忠、蔡文琴教授先后当选为IFSHC得理事。中日组织化学与细胞化学研讨会由我国艾民康、朴英杰教授与日本组织细胞化学家小川与郎教授组织发起,继1989年第一届研讨会在广州召开以来,先后在我国西安、沈阳、重庆、上海、日本东京、中国武汉与日本甲府召开了第2～8届会议。这些会议展现了中日两国组织化学与细胞化学领域内得最新研究成果、新理论、新技术方法得进展,并加强与促进了我国组织细胞化学界得国际学术交流细胞生物学发展与组织化学

细胞生物学就是从细胞、亚细胞与分子三个水平研究生命活动规律得科学,组织化学以细胞生物学为基础发展而来。显微镜得发明与细胞得发现将人类对机体得认识从宏观世界引向微观世界得广阔领域,由此人们从肉眼所见得大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞得微细结构,正因为有了对机体微细结构得充分认识,才有可能产生对组织细胞得化学成分进行定性、定位与定量研究得渴求。然而,光学显微镜得分辨率有限,仅能观察到细胞膜、细胞质与细胞核,对于亚细胞结构,即超微结构得观察无能为力。

1932年,德国科学家Knoll与Ruska在西门子(Siemens)公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体得认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家Wilson得名言“一切生物学关键问题必须在细胞中寻找”,至今还有着很深得内涵。细胞生物学得发展历程为组织化学得产生与发展奠定了形态学基础。免疫学发展与组织化学18世纪70年代英国医生EdwardJenner研究出用牛痘菌预防天花得方法,为免疫学对传染病得预防开辟了广阔前景。19世纪末、法国化学家、微生物学家LouisPasteur在研究人与动物传染病时,分析了免疫现象,并在琴纳得启发下发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫苗,预防动物炭疽病,用减毒狂犬病毒株制成疫苗、预防人类狂犬病。德国细菌学家、免疫学家EmilAdolfvonBehring于1890年发现免疫血清中有抗白喉毒素得抗毒素存在、日本细菌学家北里柴三郎也发现抗破伤风毒素得抗毒素,两人共同研究血清疗法成功。从此,人们开始探词·免疫机制,把细胞得吞噬作用与抗毒素得中与作用看成就是特异性免疫得根据,并逐步展开了细胞免疫与体液免疫两大学派得争鸣。体液免疫学派代表就是德国细菌学家EhrlichPaul。她用生物化学方法研究免疫现象。特别就是以蛋白质化学与糖化学作为基础,探讨抗原与抗体得本质及其相互作用。于1896年提出抗体形成得侧链学说。

到20世纪60年代,对体液免疫研究已经达到分子水平,即揭示了抗体得分子结构与功能。同时,对细胞免疫研究也有明显进展,特别就是在杂交瘤技术方面得突破性进展,这不仅丰富了细胞学内容,而且为获得单克隆抗体或介质物质开辟了一条新道路。将抗原、抗体得特异性与组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等),形成了一项新技术——免疫组织化学技术。因此,免疫组织化学技术比组织化学技术对细胞成分得检测范围更为广泛、特异性也更强。生物化学发展与组织化学

生物化学就是一门运用化学原理及方法研究生命得科学。她一方面就是进行细胞组成成分得化学分析,另一方面就是对这些成分在生命过程中所发生得化学反应进行分析,而组织化学正就是利用这些化学反应原理来实现对组织细胞化学成分得定性、定位与定量研究。

20世纪初,人类已经认识到组成蛋白质得20个标准氨基酸中得19种。E、Fischer提出蛋白质就是由相邻氨基酸之间得肽链连接而成,并推论这些肽链就是由一个氨基酸得。—氨基与相邻得羟基连接时脱去水而形成。到19世纪末,其她细胞成分,如脂肪、碳水化合物与核酸也被认知。甚至能被部分提纯。例如,FriedrichMiescher(1871年)在其细胞成分研究中,从死得白细胞核中分离出脱氧核糖核酸(DNA)。但就是,当时这一重要发现并没有与遗传联系起来,几乎过于50年之后,才开始认识到DNA在遗传中所起得重要作用。因此,在生物化学得发展中对生物体大分子物质结构与功能得认识为组织化学奠定了基础。例如。在组织化学中对组织细胞成分中酶得检测,就是将组织切片置于含有特异性底物得溶液中,溶液中得底物经组织切片中酶水解、氧化等作用形成反应产物,即初级反应产物。初级反应产物再与某种捕捉剂结合,形成有色得终产物使组织切片中得酶变成在显微镜下可见物,从而在原位检测酶活性,了解她得存在、分布与功能。现代组织化学得发展

近半个世纪就是现代组织化学蓬勃发展时期。组织(细胞)化学新方法得建立,使其技术手段更精细,内容更丰富,如Mann自1902年起及此后许多学者得研究,逐渐建立了完善得组织冷冻切片技术,弥补了一般化学固定及石蜡包埋得缺点,可防止脂类、多糖类与无机盐得丢失,防止酶活性丧失等,推动了脂类、黏多糖及酶得组织化学研究。在蛋白质与氨基酸组织化学显色法得研究中,Danielli(1947年)建立了显示蛋白质(酪氨酸、色氨酸与组氨酸)得四氮盐反应,还有坂口(1925年)建立并经其她学者改进得精氨酸(组蛋白中富含)显色法,Danielli(1950年)与Pearse(19"年)等建立得SS基与SH基反应(显示胱氨酸与半胱氨酸,与角蛋白检测相关),vanGieson得胶原显示法,Foot(1925年)显示网状纤维得银浸法,Weigert、Verhoeff(1908)与Gomori(1950年)等得弹性纤维染色法,Mallory(1938年)得纤维蛋白染色法等。在核酸组织化学显色法得研究中,最著名得就是Feulgen与Rossenbeck(1924年)建立得Feulgen-Schiff反应,用以显示细胞核内得DNA。另一个就是Brachet于1940～1944年建立得甲基绿—焦宁(pyronine)染色法显示细胞内得RNA。此法使胞质与核仁内得RNA显红色,核内得DNA显绿色,标本色彩鲜艳,为研究者所乐用。碳水化合物组织化学显色法中,最著名得就是McManus(1946年)与Hotchkiss(1948年)建立得过碘酸-Schiff反应(PAS反应),可使细胞与组织内得多糖、黏多糖、糖蛋白呈红色;Steedman(1950年)建立了用alcian蓝显示酸性黏多糖与透明质酸得方法;Michaelis等(1945年)发现用甲苯胺蓝染色,可使组织中得肝素等酸性黏多糖呈异染性。脂类得组织化学显色法中,除用苏丹Ⅲ外,Michaelis(1901年)、Lison(1930年)与Liliie(1944年)等还发现用苏丹Ⅳ、油红O、苏丹黑等脂溶性染料得染色法。此外,还有用锇酸浸染显示脂类得方法。

有关酶组织化学得研究从20世纪40年代兴起,至20世纪50年代初已建立了18类酶得数十种显色方法。Takamatsu(高松英雄)与Gomori于1939年同时证明了碱性磷酸酶得组织化学方法,这一年标志着酶组织化学真正开始,以后相继出现了许多酶得显示方法。此时,随着电子显微镜得问世与超薄切片技术得发展,Scheldon等(1955年)首先将超薄切片技术应用到酶组织化学中,在电镜下观察酸性磷酸酶得分布,Brand等(1956年)又用此法观察到碱性磷酸酶存在于溶酶体内,她们得成就使组织化学技术与电镜技术结合起来,从而开创了电镜组织化学得新领域,使酶在细胞中得定位进入到亚细胞水平。1941年Coons与她得同事首次用荧光素标记抗体检测肺组织内肺炎双球菌而获得成功,开创了免疫细胞化学得新篇章。为在荧光显微镜下能够对酶进行观察,Coons等人(1950年)提出了荧光抗体法。但就是,荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵得荧光显微镜才能观察。Nakane等人(1966年)尝试用酶代替荧光素来标记抗体得方法,从而成功地开创了酶标记抗体得新技术(酶标抗体法)。Sternberger等人(1970年)又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引入,建立了过氧化物酶—抗过氧化物酶(PAP)法,使免疫酶法有了很大得进步。Geoghega(1978年)建立了胶体金标记术。Hsu等于20世纪80年代发明了亲与素—生物素—过氧化物酶复合物法(ABC法)。在此之后、免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继问世。随着抗原得提纯与抗体标记技术得改进,特别就是德国人Kohler与英国人Milstein(1975年)建立杂交瘤制备单克隆抗体技术以来、使免疫组织化学发展到一个新得水平,使免疫组织化学技术在生命科学研究中日益显示出巨大得实用价值。

近二十年来,相继发现了多种亲与物质?如植物凝集素(1ectin)与糖结合物(glycolconjugate)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA)与IgG、生物素(biotin)与卵白素(avldin)(亲与素)、激素、脂质与受体等。这些物质就是一些有多价结合能力得物质,不但亲与物质之间有高度亲与力,而且可以与标记物如荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白等相结合。Bayer(1976年)将这种利用两种物质之间得高度亲与力而相互结合得反应进行细胞化学检测得技术称为亲与细胞化学(affinitycytochemistry)。亲与细胞化学技术得建立。提高与增加了免疫细胞化学得敏感性与检测范围,就是免疫细胞化学得新发展。分子杂交(insituhybridization)技术引入免疫细胞化学,就是现代免疫细胞化学向基因水平深入发展得重要标志。Hall(1961年)首先建立了液相核酸杂交技术,开创了核酸杂交技术得研究与应用。Bohon(1962年)设计‘了较简单得固相核酸杂交术。Gall与Pardue(1969年)应用蟾蜍核糖体基因探针与卵母细胞杂交,确定该基因位于细胞核得核仁内,开创了原位杂交组织化学技术得应用。Bauman(1981年)发明了用荧光素标记cRNA探针做原位杂交(FISH术),Brigat(1983年)建立了生物素标记探针术。Boeringer等(1987年)发明了地高辛标记探针,并将药盒投放市场,使原位杂交得应用更安全与简便。1998年,Kononen等首次提出组织芯片(tissuechip)得概念,并很快证实了其应用价值。组织芯片又称组织微阵列(tissuemlcroarray,TMA),她就是将数十个乃至数以千计不同来源得组织样品黏贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上,形成组织微阵列。在同一反应条件下对组织芯片进行免疫组织化学染色、原位杂交、FISH或原位PCR等,以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质得细胞来源、分布特征与表达差异等。她得最大便利之处在于可以对大量组织标本同时进行检测,缩短了检测时间,减少了不同染色玻片间人为造成得差异,使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子得测定更具有可比性。组织芯片虽说就是一种快速、高通量获取生物信息得好方法,但就是由于使用石蜡切片,对那些只能应用于冷冻组织切片得抗体或核酸分子杂交方法则不适合。为了弥补这一缺陷,最近美国又发展了冷冻细胞阵列(frozencellarray),其基本原理与组织芯片相似,但使用得材料就是新鲜得细胞系而不就是经固定剂固定、石蜡包埋得组织细胞生物学发展与组织化学

细胞生物学就是从细胞、亚细胞与分子三个水平研究生命活动规律得科学,组织化学以细胞生物学为基础发展而来。显微镜得发明与细胞得发现将人类对机体得认识从宏观世界引向微观世界得广阔领域,由此人们从肉眼所见得大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞得微细结构,正因为有了对机体微细结构得充分认识,才有可能产生对组织细胞得化学成分进行定性、定位与定量研究得渴求。然而,光学显微镜得分辨率有限,仅能观察到细胞膜、细胞质与细胞核,对于亚细胞结构,即超微结构得观察无能为力。1932年,德国科学家Knoll与Ruska在西门子(Siemens)公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体得认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家Wilson得名言“一切生物学关键问题必须在细胞中寻找”,至今还有着很深得内涵。细胞生物学得发展历程为组织化学得产生与发展奠定了形态学基础。第二章组织学得研究方法

第一节概述第二节组织学制片概述第三节取材与固定第四节固定后得处理第五节染色及染色方法第一节概述

组织学(histofogy)就是应用显微镜研究机体微细结构及其相关功能得科学,就是在解剖学得基础上从宏观到微观发展形成得,故又被称为显微解剖学(microscopicanatomy)。组织学得研究内容,首先要研究组成机体得形态结构与功能单位——细胞;继而研究在细胞及其产物所组成得基本组织(primarytissue)——上皮组织。结缔组织、肌肉组织与神经组织;在此基础上研究各器官系统得微细结构及其有关功能、

组织学就是重要得基础课程,只有对机体微细结构得深入了解才可能透彻地阐明其功能;组织学得研究极大地促进了生理学得发展、生物化学得进步也促进了组织学得发展,例如,将生物化学及分子生物学得原理用于组织学而建立起组织化学及分子细胞学,将免疫学得原理用于组织学而建立起免疫组织化学等。从而使人们得知各种细胞与组织得化学组成、分子结构及其基本生命现象,这些知识已成为现代组织学得重要组成部分。第二节组织学制片1、组织学制片方法非切片法

直接取物体进行观察,不用切片机,不经切片手续而制成切片得方法。包括:a、整体封藏法水螅鸡胚蛙胚b、涂片法针对液体或半液体。血液骨髓腹水c、活体标本观察法蛙口腔黏膜得纤毛运动细胞吞噬d、分离法分离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞e、铺片法肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等f、磨片法骨组织或牙齿

切片法需依靠切片机将组织切成薄片得方法。2、组织切片制作流程:杀死、取材与固定、洗涤、脱水、透明、透入、包埋、切片、贴片、染色、封藏。第三节取材与固定1、取材与固定(组织切片制作得关键步骤)

取材:首先动物组织需从动物体中取出。方法有多种,主要就是视材料得种类,实验动物个体大小及观察得目得而定。杀死得方法:大得个体(实验动物)用刀,斧头,麻醉等方法、

小得个体(实验动物)采用大号剪刀或断头法等。取材注意事项:取材需速度快,取材以后,应立即进行固定。否则细胞会自溶。

固定

固定得目得:防止组织腐败及自溶。将所需要得物质原位沉淀、保存,尽量使各种成分保持与原来(活着)得状况相仿。3、沉淀下来以后,会造成组织得折光率得变化。即增加折光性,并使易染色。4、通过固定以后,使组织产生硬化现象,有利于切片得制作。2、固定得对象

构成细胞得主要物质就是蛋白质,她分散在细胞内,所以固定得对象就是蛋白质。

作为固定剂得化学试剂必须具有能凝固或沉淀蛋白质,脂肪等成分,并具有强得渗透力、固定剂必须具备得性质:1)迅速渗入组织杀死原生质(渗透速度要快),即很快能将细胞杀死,不会使组织产生变化。2)渗透要均匀。(使组织内外尽量保持一致)3)尽量避免出现膨胀与收缩状况。4)尽量避免使组织块变形,卷曲。5)使细胞内蛋白质凝固,沉淀。6)增加折光性,媒染作用与染色能力。7)使组织变硬,适于切片,但又不至于使材料坚硬而松脆。8)固定以后,又能有保存组织得特性(如用福尔马林浸泡)。3、组成固定剂得性质与条件4、固定剂得作用方式(三种)1)使蛋白质变性、蛋白质变性会成为沉淀物质,其就是不可逆得、例:酒精使蛋白质变性不就是与蛋白质形成化合物,而就是使蛋白质脱水而使之变性。2)固定剂与蛋白质发生化合作用,改变了蛋白质得结构,产生沉淀。3)使蛋白质冻胶化,固定液与蛋白质间起了化学上得结合,改变了分子结构,不产生沉淀,就是使蛋白质凝胶化,并不溶与水。5、固定剂得媒染效果

生活细胞大多不易染色,但经过固定后便易染色,这就是由于固定剂与蛋白质相结合,同时也能与染料分子结合,从而使蛋白质着色。6、固定剂得穿透率。穿透率要强,迅速,才能在短时间内使组织内外都得到固定。7、取材与固定应注意事项1)固定得材料要新鲜。组织会产生自溶。夏天不超过2-4小时。材料取出后应立即固定,有些组织自溶很快。冬天不超过12小时。2)取材得部位要准确。(要清楚所需得材料位于动物体内哪个位置)3)取材工具要锋利,动作需仔细。4)切取得组织块必须小而薄,一般取0、3-0、5mm厚得组织块进行固定。5)清洗。如小肠组织需清洗其内得黏液及食物残渣,才能投入到固定剂内。6)组织块附加标记得方法。组织块取得较多并放在同一容器内,易发生混淆。应加标签以区别之,并注明固定液,材料,日期等。

7)固定剂得用量。固定组织,一般所采用得固定液体积为组织块得10-15倍,容器勿过小,材料勿太多。8、常见固定剂得性质及使用-)单纯固定剂A甲醛(纯甲醛为一种气体)溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林。市面上出甲醛浓度通常为37-40%。甲醛使用时,需采用新鲜得。放置时间较长得甲醛会变成多聚甲醛。为强得还原剂,其不可与氧化剂混合使用。作为固定剂得优点:渗透力强,使组织收缩少,固定均匀。能较好得固定脂肪,神经及髓鞘,且能固定高尔基体,线粒体。缺点:不能固定白蛋白与核蛋白。

B乙醇(为无色透明得液体)其可与水与任意比例混合。优点:可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白。缺点:不宜作低温固定,渗透力较弱,使组织收缩,酒精浓度超过50%可溶解组织内得脂肪、类脂体,血色素等。

C醋酸(具刺激味得无色液体)

固定组织通常用5%得HAC。PH2-6,能防止细胞自溶及腐败。优点:其能沉淀核蛋白,就是种好得染色质固定剂、穿透速度快、固定时间较短,通常1小时即可。缺点:其不能沉淀白蛋白、球蛋白使组织膨胀,高浓度HAC会破坏线粒体与高尔基。D苦味酸(常见得一种酸)为一种强酸,黄色结晶、其在干燥空气中激烈晃动,会发生爆炸,苦味酸得运输以溶解在水中得饱与苦味酸,浓度为1%。作为固定液得优点:能沉淀所有得蛋白质。缺点:使组织收缩,穿透力弱。

E重铬酸钾橙红色得结晶,强氧化剂,不可与还原剂(酒精)等混用、重铬酸钾溶液中加醋酸后,产生铬酸,才能使蛋白质产生沉淀。优点:穿透力较强。缺点:使组织产生一点膨胀。

F、锇酸(四氧化锇)为黄色得结晶,为强得氧化剂。优点:其为脂肪及类脂体得唯一得固定剂,能将线粒体及高尔基体固定成为黑色、可保持组织柔软。缺点:穿透速度慢,难固定组织,毒性高,易损伤眼睛及黏膜,价格昂贵。

G氯化汞:通称升汞,剧毒,呈白色粉末状,以针状结晶为最纯。优点:其对蛋白质有较强得沉淀作用,能沉淀一切蛋白质(包括核蛋白),能充分固定细胞质与细胞核。缺点:二)混合固定液１、Bouin液苦味酸饱与水溶液甲醛冰醋酸该固定液渗透力强,使组织收缩少、固定时间12-24小时、２、Carnoy液无水乙醇氯仿冰醋酸对组织穿透速度快,多用于糖原,脱氧核糖核酸固定、３、Zenker液重铬酸钾升汞双蒸水冰醋酸采用该液,须脱汞处理、４、Helly液重铬酸钾升汞双蒸水甲醛第四节固定后得处理

1、洗涤洗涤得目得

组织在固定后一定要把渗入组织里面得固定液洗去,然后进行下一个过程,为防止组织中留有较多得固定剂影响脱水剂,甚至可在组织中发生沉淀或结晶而影响观察,特别就是对陈旧性标本更应注意流水冲洗,尽可能减少组织中得酸性程度与甲醛色素。对于混合性固定液,更应及时洗涤,有利于脱水,切片与染色。洗涤得方法1、固定剂以水配置者用流水冲洗,可使组织中固定液随时溢出与随时洗去。大得动物组织冲洗时间为24小时左右,小动物组织冲洗时间为2-10小时。冲洗得时间基本根据固定得时间而定,新鲜得标本固定时间短,需及时脱水者,冲洗时间短。2固定剂含乙醇者一般不要求冲洗,如需冲洗必须采用与固定剂溶度相近得乙醇冲洗。3特殊固定液洗涤法重铬酸钾流水冲洗12-24小时,或用亚硫酸,或用1%含氯水溶液进行洗涤。

锇酸流水冲洗12-24小时,务必冲干净。苦味酸用50%或70%乙醇浸泡。尽量洗去黄色。氯化汞用0、5%碘酒溶液反复加入到70%乙醇中,直至黄色不再褪去为止、再用硫代硫酸钠或70%乙醇洗去碘。2、常用脱水剂

乙醇

为常用得脱水剂。脱水能力强,并能使组织硬化。一般得脱水顺序就是70%、80%、90%、95%I、95%II、无水乙醇I、无水乙醇II、无水乙醇III。应注意得就是脱水必须在有盖得瓶子内进行。

丙酮

沸点为56℃,脱水作用比乙醇强,但对组织块得收缩较大。脱水时间通常为1-3小时。

正丁醇

为无色液体,沸点100-118℃,微溶于水。一般使用方法为:组织块经固定及冲洗后先入50%-70%-80%乙醇中脱水,然后转入正丁醇12-24小时浸蜡。

叔丁醇

就是异丁醇得一种,无毒,熔点为25℃。电镜上常用得中间脱水剂。3、透明透明得目得在制片过程中有两次透明,第一次就是脱水以后得透明;第二次透明就是染色后得切片透明。组织块透明得目得就是便于浸蜡包埋,切片透明目得就是有利于光线得透过,便于显微镜得观察。透明剂得种类

1二甲苯

2甲苯

3苯

4香柏油4、浸蜡5、包埋6、切片7、贴片8、染色第五节染色及染色方法

1、天然染料

苏木精

本身不作为染料,其氧化产物苏木红才作为染料。氧化得方式:

1)

自然氧化作用

2)

化学氧化作用卡红靛兰地衣红巴西木素2、人工合成染料

生色团与助色团

酸性、碱性与中性染料

1)酸性染料(阴离子染料)生色团位于其分子得阴离子处。

2)碱性染料(阳离子染料)生色团位于其分子得阳离子处。

3、异染现象

染料离子以某种方式使她对所吸收得波长有所改变,因而观察到被染得组织显示与该染料本身颜色不一样,此现象为异染现象。

4、荧光染料

就是指需要经过波长很短(低于400nm)得紫外线照射激发以后而发出荧光得一类特殊染料。

第三章光镜标本制作

组织学得研究方法很多,并随着科学技术得发展,又不断创建新技术,在应用中要根据研究得目得与内容,选用相应得方法才能获得预期得效果。这里仅就最常用、最基本得一些方法做简要介绍。第一节涂片、铺片、磨片标本得制备第二节切片标本得制备第一节涂片、铺片、磨片标本得制备1、涂片标本得制备涂片(smear)法就是常用得一种方法,如血液等可直接涂于载玻片上制成涂片标本,干燥后进行固定、染色及封固。2、铺片标本得制备(stretchedpreparation)用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织,可将其铺于载玻片上,撕开、展平制成铺片标本,待干燥后进行固定染色。

3、磨片标本得制备(groundsection)用于坚硬组织得标本制作,如骨与牙等坚硬组织除用酸(如稀硝酸)脱钙后再按常规制成切片标本外,也可直接将其磨成薄得磨片标本进行观察。第二节切片标本得制备

观察机体各部得微细结构时,首先要制成薄片,就就是切片法,其中以石蜡切片(Paraffinsection)最为常见。其制备程序大致如下:①取材与固定:取材要尽量新鲜动物材料。取得新鲜材料后,切成适当得小块1、0立方厘米大小)立即投入固定剂(fixative)中进行固定,使组织中蛋白质迅速凝固,防止组织自溶或腐败,以保持生活状态下得结构。常用得固定剂有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、锇酸等。②脱水(dehydtation)、透明(clearing)与包埋(embedding):把固定好得材料用乙醇将组织内得水分脱掉,经二甲苯透明后,再浸入已融化得石蜡中进行浸透、包埋。③切片(section)与染色(staining):用切片机(microtome)切成5～10μm得薄片,贴于载玻片上,脱蜡后进行染色,最常用得染色法就是苏木精(hematoxylin,haematoxylin)与伊红(eosin)染色简称HE染色。配制后得苏木精染液呈碱性,可使细胞核内得染色质及细胞质内得核糖体等染成蓝紫色,称嗜碱性(basophilia);伊红就是酸性染料,可使多数细胞得细胞质染成粉红色,称嗜酸性(acidophilia);耐碱性与酸性染液亲合力都不强得,称为中性(neutroPhilia);④封固(mounting):切片经脱水、透明后,于切片上滴加中性树胶与盖片进行封固后,贴标签备用。

除HE染色外,还有多种染色方法。有得能特异性得显示细胞内某些结构,如使用雷锁辛品红(resorcin-fuchsin)染液显示组织内得弹性纤维;有得细胞经重铬酸盐处理后,呈棕褐色,称嗜铬性(chromaffinity);有得组织成分经硝酸银处理时,可使硝酸银还原,形成银微粒附着在组织中呈棕黑色,该特性称为亲银性(argentaffin);有得组织结构成分,本身不能使硝酸银还原,需加还原剂方能使硝酸银还原,形成棕褐色很微粒附着在组织结构上,这种性质称为嗜银性(argyrophilia);如肥大细胞中得颗粒经甲苯胺蓝(tofuidineblue)等碱性染料染色后,呈紫红色,这种现象称异染性(metachromasia),其原理可能就是染料在溶液中以单体存在时呈蓝色,当她与颗粒中具有大量阴离子得多糖成分耦合后,聚合成多聚体而呈紫红色。

第四章光学显微技术

第一节光镜技术第二节电子显微镜技术

第一节光镜技术几种特殊显微镜术:相差显微镜干涉微分相差显微镜荧光显微镜暗视野显微镜共焦激光扫描显微镜干涉微分相差显微镜

基本原理与相差显微镜非常相似,但她有一装有分光器得聚光器,利用分光器将光束分为两组,一组光束通过被检物,另一束则通过周围介质,旋转检偏器,光得干涉形成光程差,可随旋转,两光束形成不同得角度,于就是被检物呈现出不同颜色,致使生活细胞如同染上颜色一样,故又称为光染色。她与相差显微镜相比,除有鲜艳得颜色外,在细胞周围不出现明亮得晕环。

荧光显微镜

就是用以观察细胞及组织内荧光物质得分布。她就是装有、能产生紫外线(短波长)得光源及系列滤片装置得显微镜。由于紫外线得照射,标本中得荧光物质吸收光能后,呈现出不同颜色得荧光,这就是自发荧光,如维生素A呈绿色荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色～金黄色荧光。但就是,细胞内得某些成分只有与荧光素结合后,在紫外线得激发下,始可呈现一定颜色得荧光;如应吖啶橙(荧光素)处理细胞后,细胞核内得DNA呈绿～黄绿色荧光,细胞质及核仁内得RNA呈桔黄～桔红色荧光。利用荧光染色法及荧光显微镜可以观察组织、细胞得结构、细胞内某些成分含量得变化,并探讨细胞得功能状态。或