分子生物学技术原理

分子生物学技术1第一节分子生物学技术原理2细胞的分子基础3基因是生物进化的物质基础4SpeciesGenomesize(Mb)NumberofchromosomesHuman30002n=46Mouse27002n=40Pig27002n=38Cow30002n=60Fugu400Zebrafish17002n=50Chicken12002n=78Honeybee180n=16Drosophila1652n=8C.elegans

1002n=12Rise4302n=24Wheat17,0002n=6x=42Arabidopsis1002n=10Tomato9502n=24Maize25002n=20WhiteSpruce10,0002n=24S.cerevisiae15n=16E.coli4.7n=1H.influenze1.8n=1Mycoplasma

genitalium0.58n=1Genomedataforplantandanimalspecies5基因（gene）：核酸分子中储存遗传信息的遗传单位。即储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。基因组（genome）：细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。6基因与疾病染色体缺陷——新生儿畸形、愚钝细胞分裂、增殖相关基因突变——肿瘤免疫相关基因缺陷——自身免疫病、抗感染差生化代谢过程基因缺陷——解毒功能差、易受环境因素致癌7基因组计划人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。

我国于1999年9月积极参加到这项研究计划中的，承担其中1%的任务，即人类3号染色体上约3000万个碱基对的测序任务。8细胞核是细胞代谢、生长、分化的控制枢纽9DNA分子携带遗传信息101112DNA的结构与功能13DNA主要功能是贮存复制和传递遗传信息14遗传信息的传递15161718中心法则192021蛋白质分子结构222324252627

理解遗传因素如何影响人类疾病的探索正在加速进行28第二节核酸分子杂交技术与应用29一、核酸分子杂交的基本原理

（一）核酸分子杂交的基本原理

1、变性（denaturation）

（1）定义：

在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。

30（2）.引起核酸变性的因素酸碱热变性剂（尿素）有机溶剂（乙醇）312、融解温度：

定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最

大值一半时的温度。32影响Tm的因素：

（1）DNA碱基的组成

G-C含量越多Tm值越高

A-T含量越多Tm值越低33（2）溶液的离子强度

低离子强度Tm值越低

高离子强度Tm值越高（3）pH值

pH值5-9Tm值变化不明显

pH<4pH>11不利于氢键形成

（4）变性剂

干扰碱基堆积力和氢键的形成343、复性

变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。

影响复性速度的因素：

DNA浓度

DNA片段的大小

DNA片段复杂性

合适的复性温度

适当的离子强度

354、杂交

定义

两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。分类

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA3637(二)核酸探针

概念

探针（probe）

指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。

例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。

核酸探针

指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。3839二、分子杂交技术

液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片

（一）液相分子杂交

将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。

40（二）固相分子杂交

将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛应用。411、Southern印迹杂交

膜上检测DNA的杂交技术，1975年由EdwinSouthern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。

42432、Northern印迹杂交

应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。

443、原位杂交

定义：

将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（hybridizationinsitu)。

2、操作步骤：

载片的清洁与处理

组织与细胞的固定

探针

湿盒

45464、基因芯片技术

是集成化的核酸分子杂交技术。47第三节PCR技术原理与应用48PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））1971Khorana等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。

49体内DNA的复制体系拓扑异构酶解旋酶类SSB

引物dNTPMg2+5’

3’50Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段51Taq

DNA聚合酶（thermus

aquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。52PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸53

PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火54TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+551PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。

DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

PCR反应条件56（2）引物

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。57（4）dNTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。58（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。

Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。

Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。592循环参数变性

使双链DNA解链为单链

94℃，20-30秒(2)退火

温度由引物长度和GC含量决定。复性温度=Tm值-(5～10℃)

增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。60（3）延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数

主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加613.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。琼脂糖凝胶电泳62PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达109拷贝PCR产物每轮循环增加一倍632）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。64引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。653）操作简便易行

利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。66应用定性研究：用于检测特定基因序列的存在或缺失定量研究：用于定量检测目的基因67用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳12368LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分69标记引物ＰＣＲ观察PCR产物70原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。71操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达72ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增73荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料 SYBRGreenI序列特异性探针

Taqman

MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特异性探针

Amplifluor(Intergen)74

与普通PCR的区别

普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。7576每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。77

定量PCR的数学原理

7879斜率与扩增效率8081

荧光定量PCR化学原理

非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen

特异性荧光标记：

2、TaqMan821、SYBRGreen法83SYBRGreen熔解曲线分析

84SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA

使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜852、TaqMan探针法

86TaqMan作用机理

87

TaqMan法优缺点

88Real-timePCR方法应用89•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原体检测转基因食品检测基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究90

绝对定量与相对定量的定义

91绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：•含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒•含有和待测样品相同扩增片段的cDNA•PCR的产物92绝对定量：从荧光到拷贝数

93

相对定量通过内标定量

内标（EndogenousControl）通常是