《宠物疫病与公共卫生》实训17课件讲解

鸟新城疫的实验室诊断技术实训目标本实验以新城疫为例作为鸟类病毒性疾病诊断技术的代表，要求比较系统地了解新城疫的实验室诊断技术，以达到触类旁通的目的；掌握新城疫的免疫监测技术。主要仪器设备与场地1.设备材料：被检病料、新城疫被检血清、新城疫标准抗原，、新城疫阳性血清(HI效价为1:640)、9～10日龄鸡胚、生理盐水、阿氏液、青霉素、链霉素、75%酒精棉球、5%碘酊棉球、孵化器(或电热恒温箱)、照蛋器、锥子、蛋架、玻璃注射器(1ML、5ML或10ML)、刻度吸管(0.5ML、1ML、5ML、10ML)、手术剪刀、眼科剪刀、眼科镊、组织镊、试管架、研钵、电动离心机、微型振荡器、微量加样器、96孔V型反应板、1%鸡红细胞悬液、ф2～3mm塑料管（一次性输液管）、记号笔、酒精灯、培养箱。2.场地：传染病实验室。病料的采取和处理材料应采自早期病例，病程较长的不适宜于分离病毒。病鸟扑杀后无菌采取脾、脑和肺组织；生前可采取呼吸道分泌物。将材料制成1:5～1:10的乳剂，并且加入青霉素、链霉素各1000IU/ML，以抑制可能污染的细菌，置4℃冰箱2～4hr后离心，取其上清液作为接种材料。同时，应对接种材料做无菌检查。取接种材料少许接种于肉汤、血琼脂斜面及厌氧肝汤各一管，置37℃培养观察2～6d，应无细菌生长。如有细菌生长，应将原始材料再做除菌处理，如有可能最好再次取材料。病毒的分离培养常用9～11日龄的非免疫鸡胚，划出气室，在接近气室的绒毛尿囊膜而无大血管处作一标记，用碘酒消毒，并在此点锥一小孔，再在气室端钻一小孔，供排气用（图10-4a）。将针头与蛋壳成30度角刺入注射孔3～5mm，注入上述处理过的材料0.1～0.2ML于尿囊腔内。亦可在气室部距气室边缘0.3～0.5cm处的蛋壳上穿一小孔，针头垂直刺入约1～1.5cm（估计已透过绒毛尿囊膜），即可注入接种材料（图10-4b）。接种后用石蜡封口，气室向上，继续置35～37℃孵化箱中孵育，每天照蛋1～2次，继续观察4～7d。病毒鉴定对血凝试验呈阳性的样品采用新城疫阳性血清进一步进行血凝抑制试验。如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用初代分离的尿囊液继续经鸡胚传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。被检血清的制备刺破鸟翅静脉，用塑料管引流吸取血液至塑料管长度的2/3处（长3～5cm），然后将塑料管的一端在酒精灯上熔化封口。在管上贴胶布注明鸟号，待血液凝固后，经1500r/min离心5min，取血清备用。在免疫鸟群中定期随机取样，抽样率保证有代表性，每群一般采16份以上血样。鸟群小的采样比例为3%～10%，大的为0.1%～0.3%。原则上，小鸟群（100只以上）的采样不能少于10只，大鸟群（万只以下）不少于50～100只，万只以上的大鸟群，可按0.1%～0.5%的比例采样。1%鸡红细胞悬液制备经翅静脉或心脏采集2～3只健康公鸡（最好未经新城疫免疫或接种时间较长）血液与阿氏液混合后，置刻度离心管中用1500rpm离心8min，弃上清，沉淀物再用生理盐水混匀，经离心洗涤3次，最后根据离心压积的红细胞量，用生理盐水配制成1%红细胞悬液。血凝试验首先在96孔V型反应板1～12孔各加生理盐水50uL。再用微量移液器取50uL被检抗原于第1孔，吹吸3次（或用稀释棒）混匀后，吸50uL至第2孔，依次做倍比稀释至第11孔，再从第11孔吸取50uL弃去，第12孔不加抗原作对照。然后换一个吸头，依次在各孔加入1%红细胞各50uL。最后在微型振荡器上振荡1min，在20～30℃静置20min，每5min观察1次，观察1hr，以血凝图象判定结果血凝抑制试验首先在1～12孔各加入生理盐水50μL。用微量移液器吸50μL被检血清于第1孔内，吹吸4次混匀后，吸50μL至第2孔，依次做倍比稀释至第11孔，再从第11孔吸取50μL弃去。然后换一个吸头向1～12孔各加入50μL4个血凝单位病毒液，