植物组织培养过程及问题控制

项目四：植物组织培养的

培养条件及培养过程一、培养条件在植物组织培养中，温度、光照、湿度、氧气等各种环境条件及培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组培苗的生长和发育。环境条件培养室是培养试管苗的场所，要满足外植体生长所需的温度、光照、湿度和空气等条件。1.温度温度会影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。大多数植物组织培养在23～27℃之间进行，一般采用25±2℃。适宜的温度不是固定和恒定的温度，因此在培养室内需要安装温控设备，如空调。2.湿度湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和培养室内的湿度条件。（1）容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响，相对湿度几乎可达100%。（2）环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求60-70%的相对湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，改变各种成分浓度，提高渗透压，影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引发霉菌，造成污染。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。3.光照光对组织培养的影响主要表现在光照时间、光照强度和光质这三个方面。（1）光照时间

组培苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16小时的光照，８小时的黑暗，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织。（2）光照强度光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱，幼苗容易徒长。（3）光质一般而言，红光常可引起细胞干物重的增加和利于根的形成。蓝光常可引起细胞中的质体转化为叶绿体，对促进腋芽、不定芽发生的数量有明显的作用。一般组培室均选用质量较好的白色荧光灯，基本能满足组织培养的需要。4.氧气瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。二、培养过程外植体的选择与处理外植体的消毒与接种初代培养继代培养（多次循环）壮苗与生根试管苗驯化与移栽（一）组培的流程（二）培养过程中常出现的问题

污染褐变玻璃化现象组培三大难题1、污染指植物组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。（1）污染的病原：细菌污染、真菌污染（2）污染源：外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底操作人员接种不规范

接种污染培养污染（培养过程中）

（3）污染的预防措施有：防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、外植体消毒等措施；防止用具带菌

接种用的培养基、材料最好要喷酒精才拿上超净工作台。接种后有条件封膜操作室、培养室要经常消毒操作人员要操作要规范2.褐变指在组培过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，在氧气的作用下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。酚类化合物+多酚氧化酶+氧气醌类物质酶系统失活（1）褐变的原因植物品种生理状态（外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高）培养时间（培养时间

材料培养时间过长，会引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。蝴蝶兰、香蕉等随着培养时间的延长，褐变程度会加剧）培养基成分（在初代培养中，培养基中无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，导致褐变。BA和KT不仅促进酚类化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐变；）培养条件：光照和高温（2）防止褐变的措施外植体处理（流水冲洗低温处理12-24小时）；适宜的培养基；合适的培养条件；连续转移；加抗氧化剂；加活性炭；3.玻璃化现象在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。玻璃化苗的特点①玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎②叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组织而无栅栏组织③体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低④吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降低，苗生长缓慢、繁殖系数大为降低，甚至死亡⑤生根困难，移栽成活率低玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程，碳、氮代谢和水分发生生理性异常所引起。其实质是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产和积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现玻璃化。（1）玻璃化现象产生