《中国药典》二学习资料省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

《中国药典》二部主要增修订情况本版药典（二部）共收载品种1967个，新增品种327个，修订品种522个删除品种4个，转至中国药典（三部）生物制品52个。附录新增项目13个，修订项目65个，附录“生物制品通则”转至药典（三部）。制剂通则新增植入剂，修订项目19个。本版药典（二部）坚持“科学、实用、规范”标准制订标准，基本实现了中国药典设计方案所确定目标，附录检测方法及品种正文内容都有了较林改进，详细表达在以下五个方面。1/273一、及时采取先进分析方法，规范附录表达我国特色本版药典（二部）附录增订了制药用水中总有机碳测定法（TOC）。TOC方法载入药典，将引导我国制药用水质控理念更新，使我国对水中有机物限量控制愈加科学、准确，同时也将推进TOC方法在制药用水在线检验中应用，确保制药用水尤其是注射用水质量。当前，因为TOC测定仪器尚不普及，本版药典（二部）在品种正文中仍沿用中国药典标准，但为与我国药品生产管理要求相适应，纯化水与注射用水增订微生物程度检验，纯化水程度为每1ml中含细菌、霉菌和酵母菌总数不得过100个，注射用水程度为每1ml中含细菌、霉菌和酵母菌总数不得过10个。2/273纯化水重金属程度0.00005%修订为0.00003%.注射剂粒度检验方法从粒度大小为三个层次，第一为可见异物检验法（即原澄明度检验法），该法对粒径或长度通常大于50μm物质进行检验，其判断标准作了较大改动，愈加严格，即静脉注射液不得检出可见异，如有1支不符合要求，另取20支复试，均应符合要求。对于非静脉注射液以及粉针剂等由国家食品监督管理局另行分布要求。另外，本版药典新增了光散射法，该法采取仪器检测，经过对可见异物光散射能量进行测量，使结果判断更为客观。为降低市场抽验实际困难，本版药典（二部）降低了可见异物检验取样量，原部颁标准取200支，现方法取样20支。以上要求既反应我国注射液生产实际，又确保临床用药安全。3/273第二不溶性微粒检验法，该法检验粒度较小，通常为2~50μm，检测微粒浓度为0~5000个/ml，本版药典（二部）增加对100ml以下静脉注射液、静脉注射用无菌粉末及注射用浓溶液中不溶性微粒检验。第三为粒度与粒度分布测定法，本版药典（二部）增订光散射法，测量范围为0.02~3500μm，所用仪器为激光散射粒度分布仪，测定法分干法与湿法，湿法测定检测下限通常为20μm，干法测定检测下限通常为200μm。渗透压摩尔浓度测定法强调“注射剂、滴眼剂等制剂处方中氯化钠等，其作用主要为调整制剂渗透压，则可经过渗透压摩尔浓度测定取代含量。”此要求意在引导生产企业以渗透压摩尔浓度作为判断制剂等渗或高低渗客观指标。4/273二、加强安全性指标控制，科学提升标准要求本版药典（二部）对色谱方法系统适用性试验要求修订更趋合理。薄层色谱法增加对系统检测灵敏度与分离效能要求，通常要求杂质斑点数和单一杂质量，当采取系列本身稀释对照溶液时，也可要求预计杂质总量。判别时，分离度效能可用对照品与结构相同药品对照品制成混合溶液进行测试；杂质检验时，一采取杂质对照品与供试品混合溶液，二者应显示清楚分离斑点，比如左旋多巴采取左旋多巴与酪氨酸混合溶液考评系统分离效果。本版药典（二部）11个品种增订TLC检验相关物质。5/273高效液相色谱法强调色谱中难分离物质或与其相关物质之间分离度和待测响应值重复性是系统适用性试验更具实际意义主要参数，而依据当前方法学验证情况，理论板数仅作为参考参数。本版药典（二部）226个品种增订HPLC检验相关物质。部分品种要求见表1。6/273表1部分品种系统适用性试验要求表品种系统适用性试选取对照品分离度地塞米松甲泼尼龙与地塞米大于5.7地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠与地塞米松大于4.4曲安奈德曲安奈德与曲安西龙大于15氢化可松氢化可松与泼尼松龙大于2.4氢化可松琥珀酸钠氢化可松琥珀酸钠与氢化可松大于1.5倍他米松倍他米松甲泼尼龙大于2.2盐酸二甲双胍盐酸二甲双胍与双氰胺大于1.57/273品种系统适用性试选取对照品分离度格列吡嗪格列吡嗪与4-[2-（5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基）乙基]苯磺酰胺大于1.5格列喹酮格列喹酮与异喹啉物大于1.5倍他米松磷酸钠倍他米松磷酸钠与地塞米松磷酸钠大于2.0醋酸可松醋酸可松与醋酸氢化可松大于4.0醋酸地塞米松醋酸地塞米松大于11.0醋酸氢化可松醋酸氢化可松与醋酸可松大于5.58/273重视残留溶剂控制，本版药典（二部）对残留溶剂检验推荐采取顶空毛细管气相色谱法，程度与ICH一致。药品生产企业可采取简便填充柱气相色谱法进行工艺控制，其它色谱法如HPLC测定吡啶，离子色谱法测定N-甲基吡咯烷酮等，可作为气相色谱法主要补充。顶空毛细管气相色谱法应考虑共出峰干扰、热降解干扰、基质效应影响与药品溶解性及溶剂介质影响。本版药典（二部）收载化学合成原料药约100种，本版药典（二部）24个品种增订残留溶剂检验，部分品种残留溶剂种类见表2。制订残留溶剂检验方法难点在于各论中方法应满足全部企业不一样工艺；药典方法应含有很好耐用性；生产工艺改变将需要对标准进行对应修订。9/273表2部分品种残留溶剂列表品种残留溶剂盐酸多柔比星二氯甲烷甲醇丙酮美罗培南二氯甲烷与丙酮头孢硫脒乙醇与丙酮马来酸氯苯那敏四氢呋喃二氧六环吡啶甲苯盐酸曲马多异丙醇二氧六环硫酸依替米星二氯甲烷胞膦胆碱钠甲醇与丙酮泛昔洛韦二氯甲烷甲醇乙酸乙酯司帕沙星甲苯吡啶氯仿10/273品种残留溶剂盐酸昂丹司琼甲苯丙酮盐酸塞氯匹定甲苯非洛地平异丙醚马来酸依那普利乙腈磷酸川芎嗪乙醇与丙酮奥美拉唑二氯甲烷乙腈甲醇与丙酮盐酸氨溴索甲醇与丙酮穿琥宁吡啶11/273本版药典（二部）在确保安全性前提下，将热原修改为细菌内毒素品种有73个品种，增订细菌内毒素检验品种有112个，细菌内毒素判定标准由“不得过…”修订为“应小于…”，防止肉眼观察不确定性。另外，42个品种删除异常毒性；30个品种删除降压物质。12/273三、扩大HPLC在多组分原料及制剂中应用，重点加强品种要求本版药典（二部）有223个品种采取HPLC方法取代传统容量法或紫处法或生物检定法。比如盐酸小檗碱片与胶囊含量测定原来用滴定法，各种生物碱均可参加滴定反应，本版药典修订为HPLC法，可准确测定小檗碱含量；酸酸泼尼松片含量测定原采取紫外法，难以区分结构类似物质，修订为HPLC方法大大提升了方法专属性。氯霉素、罗红霉素、克拉霉素与庆大霉等各种抗生素原含量测定方法采取微生物检定法，本版药典（二部）改用HPLC法，3种氨基糖苷类采取蒸发光散射检测器。13/273本版药典（二部）品种正文中近30种复方制剂，其中18种已采脾HPLC方法。HPLC方法不但提升了方法专属性，而且简化了试验过程。比如复方磺胺甲唑制剂由磺胺甲唑与甲氧苄组成，原条用计算分光光度法，现修订为HPLC法；双唑泰栓由甲硝唑、克霉唑与醋酸氯己定组成复方制剂，原含量测定方法为滴定法、UV法与滴定法和UV组合三个方法分别测定，方法繁琐且干扰原因多，现修订为HPLC方法，在一个色谱条件下能有效分离三个组分；异福酰胺片（胶囊），采取等度HPLC方法能有效分离三种组分及降解产物醌式利福平，确保方法准确性。14/273

另外，本版药典有针对性地对61个难溶药品增订溶出度检验；对于上浮胶囊，采取溶出度一法（转篮法）和二法（浆法）时可用沉降蓝方法；原采取2片加入到至同一溶出杯方法修订为1片，如三唑片、溴吡斯明片和盐酸哌替啶片等，并经过修订检测方法使检测灵敏度满足溶出物检测要求。18个小剂量药品增订含量均匀度检验。70个原料药增订专属性红外判别。15/273四、进步实现标准科学与规范性状规范包含着色片不再描述详细颜色，如复方甲苯咪唑片原为粉红色片，现描述为着色片；将过分色包含在颜色描述中，如“本品为白色或浅黄色颗粒…”，规范为白色至浅黄色颗粒，防止用“或”引发过分颜色缺失而造成结果误判；胶囊性状统一描述内容物；栓剂不描述形状；可溶与混悬型颗粒剂等描述在本品性状中，以此判断是否进行熔化性检验。16/273实事求是地删除了试验室难以操作检测项目，如溶点过高并同时溶融分解药品不再进行溶点测定（如乙酰唑胺、盐酸丙卡巴肼、硫酸双肼屈嗪、盐酸左旋咪唑、氢化可松等），有些复盐，在过加热过程中出现多峰现象如环吡酮胺，即出现三个吸收峰，不宜进行熔点测定，故删去此项目；删去一些检验人员嗅有害气体判别试验，如甘油，删去丙稀醛刺激性臭气，用专属性强红外判别代替；对规格进行了规范，如亚叶酸钙以亚叶酸计，磷酸苯丙哌啉以苯丙哌啉计；愈加明确了一些制剂名称，如静脉输液中，…氯化钠注射液或…葡萄糖注射液以防止临床不宜人群误用。辅料设置专栏。17/273《中国药典》二部附录方法通则主要增修订内容18/273紫外-可见分光光度法1、术语紫外-可见分光光度法，吸光度2、仪器校正吸光度准确度λ(nm)235257313350124.5±1%144.0±1%48.62±1%106.6±1%123.0-126.0(±1.2%)142.5-146.0(±1.%)47.0-50.3(±3.5%)105.5-108.5(±

1.5%)19/2733、对溶剂要求、纯度，截止使用波长4、狭缝宽度小于波带半高宽1/10，以不减不吸光度为准5、溶液pH值对吸收影响6、计算分光光度法普通不宜用作含量测定。7、比色法作为测定法之一合并于本法中20/273红外分光光度法1、波数精度由-4000cm-1±4cm-1和4000-cm-1±8cm-1

改为~1000cm-1±1cm-1和~3000cm-1±1cm-1

2、分辨率1583-1589cm-1>12%T2851-2870cm-1>18%T3、同一化合物收入不一样卷次，以后卷图谱为准，前卷图谱仅作参考21/2734、多晶问题（1）要求样品前处理方法（2）当未要求药用晶型时，可用适当溶剂重结晶，或用对照品平行处理后测定5、制剂红外判别（1）品各正文中要求预处理方法（2）辅料无干扰，与原料药标准图比对（3）如辅料干扰不能完全消除，在指纹区可要求3-5个待测成份特征吸收峰（cm-1），其误差应小于0.5%。22/273薄层色谱一、仪器与材料1、固定相或载体粒径10~40μm→5~40μm2、喷雾器、显色剂与荧光检测二、操作方法1、点样点样直径2~4μm，点间距1.0~2.0cm2、展开单向、双向、屡次3、薄层扫描（删去）三、系统适用性试验（新增）1、检测灵敏度程度对照溶液再经适当稀释，应显示清楚斑点23/2732、比移值判别，杂质定位3、分离度待测物中难分离物质对应能清楚分离判别待测对照品与结构相同参考物应分离杂质检验杂质对照品与待测物主成份应分离四、测定法（新增）判别同浓度对照品溶液颜色与位置应一致斑点大小与颜色深浅也应大致相同杂质检验杂质对照品、本身对照杂质斑点数、单个杂质量、杂质总量（预计）五、检视（新增）本色、显色、荧光、荧光猝灭等24/273高效液相色谱法1、色谱柱：柱性能（载体形状、粒径、孔径、表面积等、化学修饰），手性柱2、检测器：UV、F、DR、EC、ELS、MS等采用ELSD时，由试验决定是否需要进行对数转换3、系统适用性试验（1）难分离物质正确分离度（2）柱效4、拖尾因子0.95<T

<1.05峰高法定量25/2735、明确了杂质测定中准确积分涵义C<0.5%,RSD<10%0.5%≤C≤2%,RSD<5%C＞2%,RSD<2%6、在加校正因子本身对照法中，明确了相对于主成份相对保留时间，用于要求杂质定位，并与校正因子一起载入品种正文中。26/273干燥失重测定法恒温减压干燥条件：温度60℃，压力<20mmHg27/273炽灼残渣检验法明文要求，当供试品分子中含有碱金属或氟元素时，应使用铂坩埚。28/273溶液颜色检验法增加了序言溶液颜色反应纯度无色颜色与纯溶剂相同几乎无色供试液浅于用水稀释一倍后对应一号标准比色液颜色。29/273注射液中不溶性微粒检验法1、名称：>50μm澄明度可见异物2~50μm不溶性微粒不可见微粒2、光阻法和显微镜法检验结论不一样时，以后者为准。3、取样体积5ml或随容器标示体积决定4、环境及溶剂10ml,≥10μm，<10粒；≥25μm，<2粒光阻法50ml，≥10μm，<20粒；≥25μm，<2粒显微镜法5、增加小针剂检验≥25ml5ml×3<25ml合并数支使总体积大于20ml5ml×3

或逐支检验（取样体积以不吸入气泡为限）30/2736、供试品数量3支以上7、判定光阻法：>100ml，>10μm≤25粒/ml，

>25μm≤3粒/ml≤100ml>10μm≤6000粒/支，

>25μm≤600粒/支（含无菌粉针）显微镜法：>100ml，>10μm≤12粒/ml，

>25μm≤2粒/ml≤100ml>10μm≤3000粒/支，

>25μm≤300粒/支（含无菌粉针）31/273渗透压摩尔浓度测定法1、深入明确了渗透压与渗透压摩尔浓度关系2、明确了冰点下降法测定渗透压摩尔浓度依据3、定义：mOsmol/Kg浓度由每升溶液中溶解溶质克数改为每千克溶剂中溶解溶质克数4、由一点校正法改为二点校正法5、制剂处方中氯化钠，若其作用主要为调整制剂渗透压，则可经过毫渗摩尔测定取代氯化钠含量测定32/273可见异物检验法1、名称澄明度，>50μm2、测定方法（1）灯检法照度无色注射剂1000~1500Lx透明塑料容器或有色注射剂~3000Lx混悬液4000Lx视力好于4.9矫正后好于5.0①注射液取样数20支判定未见可见异物为合格如一支中检出异物，可另取20支，均不得检出异物33/273（2）光散射法取样数与判定同灯检法3、可见异物（白点、块状物等）特殊异物（金属屑、玻璃屑、色块、粗纤维等）34/2734、《澄明度检验细则和判断标准》与《中国药典》比较《澄明度检验细则和判断标准》《中国药典》项目名称澄明度检验可见异物检验光照度要求无色1000~1500Lx有色~3000Lx无色1000~1500Lx有色~3000Lx混悬4000Lx仅检验色块、外来异物人员条件远、近距离视力≥4.9不包含矫正后视力远、近距离视力≥4.9矫正后视力≥5.035/273《澄明度检验细则和判断标准》《中国药典》项目名称澄明度检验可见异物检验检视距离20~25厘米明视距离，通常25厘米供试品数量200支20支检验方法3~6支/次，15~21秒/次未要求程度要求出厂时≤5%效期内≤7.5%不得检出；如仅检出1支，另取20支复检，不得检出。主要用水针进行比较。经典灯检法不会被淘汰，光散射法必将被广泛应用。36/273溶出度测定法1、适合用于难溶性固体制剂，增加颗粒剂溶出度检验2、仪器装置材料：不应有显著吸附和溶出网筛：丝径由0.254mm改为0.25mm网孔0.425mm改为0.40mm转速：删去50~200rpm,改为各论要求转速±4%取样点位置：转篮顶端与液面中点，距溶出杯内壁10mm处，与原要求差2~3mm溶剂：溶出介质比溶出液更适当，脱气，pH±0.0537/2733、测定法：品种各论中应明确溶出条件，通常出介质为900ml取样时间45′程度为标示量70%，并要求取出溶出液体积如大于1%溶出介质体积时，应补足或校正计算。4、过滤：取消原0.8μm滤膜，改为“用适当微孔滤膜过（自动采样滤头1~10μm）”5、处方或工艺不一样同品种，可并列溶出条件6、极难溶物溶出条件（1）加大转速、增加时限或降低程度要求（2）加表面活性剂，如SDS或吐温80＜1%（3）加有机溶剂，如乙醇、异丙醇等＜5%7、小规格药剂每杯仍以1片为宜，低吸光度溶出液可改用长光路吸收池，删支“取用量如为2片或2片以上时…..”。38/2738、囊壳干扰空白读数＞标示量25%方法无效空白读数＜标示量2%无须校正9、结果与判断合格：6（6Q）6（Q＞1~2＞Q-10%，6（1~2Q，Q-10%＞1＞Q-20%），+6复试12（3＜Q，Q-10%＞1＞Q-20%，Q平均≥Q）不合格：6（1＜Q-20%）6（2＜Q-10%）6（3＜Q）6（Q平均＜Q）12（4＜Q）12（2＜Q-10%）12（1＜Q-20%）12（Q平均＜Q）

39/273含量均匀度检验法1、计算方法CHP计量法BP/EURP计数法USP计量-计数混正当2、适用范围小剂量口服固体制剂，粘稠型注射剂，注射用无菌粉末、透皮贴剂；栓剂、单剂包装口服混悬剂、单剂量包装眼用、耳用、鼻用混悬剂、固体或半固体制剂。每片≤10mg（主药含量＜片重5%）其它制剂≤2mg（主药含量＜单剂量2%）增加每剂≤25mg（有效浓度与毒性浓度较靠近或混匀工艺较困难品种）40/273片剂脆碎度检验法对于形状或大小在检验时形成不规则滚动或由特殊工艺生产片剂而不适于本法检验时，可不进行本项检验。41/273片剂通则一、剂通则介绍片剂是制剂中最常见品种最多剂型。在各国药典中都有收载。定义：片剂系指药品与适宜辅料混匀压制成圆片状或异型片状固体制剂。分类：片剂以口服普通片为主，另外，：中国药典收载片剂还有含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、阴道片及阴道泡腾片、缓释片、控释片、肠溶片中国药典暂未收载片剂：口崩片、脉冲片。册去有速释片…..42/273口服普通片：大多数片剂包含非包衣片、包衣片（薄膜衣片、糖衣片）均属于口服普通片，应符合片剂项下相关要求：重量差异、崩解时限、含量、含量均匀度、溶出度、相关物质、微生物程度、包衣片在必要时进行残留溶剂检验（介释）43/273二、外观（中控或内控标准）应完整、光洁、色泽均匀，有适宜硬度和耐磨性，非包衣片除另有要求外（如泡腾片、冷冻干燥成型片剂….）进行片剂脆碎度检验和硬度检验。片剂脆碎度检验法：见中国药典附录XG片重为≤0.65g者，取总量约为6.5g。片重＞0.65g者，取10片，25Rpm,4′减失重量不得＞1%，且不得检出断裂、龟裂或粉碎片子。可复查2~3次，但平均减失重量不得＞1%。44/273附：片剂外观检验质量标准（参考用）项目/标准合格品（内控）优级品备注片剂外观外观完整、光洁、片型薄厚一致，色泽均匀一致，字迹图案清楚外观完整、光亮细腻、片型薄厚一致，色泽均匀一致，字迹图案清楚每批取800片，用平板法黑点异物80~100目黑点不得超出14片/800片80~100目黑点不得超出10片/800片麻面不得超出14片/800片不得超出10片/800片掉盖不得超出1片/800片不得超出1片/1250片45/273项目/标准合格品（内控）优级品备注碎片不得超出2片/800片不得超出1片/800片磕边小于2mm，不得超出14片/800片小于2mm，不得超出10片/800片粘结不得超出14片/800片不得超出10片/800片综合（总缺点）不得超出14片/800片不得超出10片/800片46/2732、重量差异概念：指定片重：理论投料量计算理论片重。颗粒平均片重：按颗粒总重量平均片重。按指定片重计算重量差异为厂定标准。按平均片重计算重量差异为法定标准。相对而言，理论片重是合理，因为颗粒收得量计算平均片重没有减除有形损耗（机器粘附、丢洒部分）和无形损耗（随气流排除部分）。不过以往片剂辅料中惯用辅料为玉米淀粉，水分在6~14%之间通常为10~11%，而干颗粒水分通常在1~2.5%之间，为此按理论片重计算会造成片重偏高。现在辅料应用已发生改变，所以按理论片重计算是较合理。糖衣片须检验片芯符合重量差异后方可包衣，包糖衣后不再检验重量差异。薄膜包衣后检验重量差异，应符合要求。47/273药典要求主药规格＜10mg片剂须作含量均匀度。凡作含量均匀度检验片剂可不作重量差异检验。3、崩解时限片剂除另有要求外，取6片，分别置吊篮玻璃管中，在37℃±1℃水温测定，15′内应全部崩解，如有1~2片崩解不完全，可复测2次。总共18片中超出要求不得多于2片。从95版开始，不加档板，筛网内径为2mm，为10目筛网。薄膜包衣片亦可改在盐酸溶液（9→1000）中进行检验，30分钟内全部崩解，如有1片不能完全崩解，可复测一次，均应符合要求。（当前薄膜包衣材料已采取水溶性或水分散性包衣材料，可用水作介质）。凡要求进行溶出度检验片剂，可不作崩解时限检验。48/273三、详细介绍含片：系指含于口腔中，药品迟缓溶解产生持久局部作用片剂。含片中药品应是易溶，主要起局部消炎、杀菌、收敛、止痛或局部麻醉作用，除另有要求外，30分钟内应全部崩解。药典要求进行释放度检验，但附录上未能提供测定方法、取样时间点及标准，中国药典从实际需要出发，给予删除。舌下片：系指置于舌下能快速溶化，药品经舌下粘膜吸收发挥全身作用片剂。除另有要求外，各片均应在5分钟内全部崩解或溶化（片将融化改为溶化）。舌下片中药品与辅料应是易溶性，主要用于急症治疗，最惯用如硝酸甘油片属于舌下片，作为血管扩张药，治疗心绞痛等急症，除符合片剂项下相关要求外，要求2分钟内起镇痛作用盐酸丁诺啡舌下片，也已收载入中国药典。49/273可溶片（片剂通则中新增内容）：系指能溶解于水非包衣片或薄膜包衣片。可溶片按崩解时限检验法检验，应于3分钟内全部崩解并溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合要求。除另有要求外，水温为15℃~25℃。关于口腔崩解片：本品作为普通片补充，主要处理无水条件下，于口腔中（舌面）快速崩解，随吞咽动作进入消化道，在口腔内应无粘膜吸收，体内行为与普通片一致，处理老年人吞咽困难及工作奏快、缺水条件下仍可能用特点。口崩片普通要求主药含量较小为宜，大部分采取直接压片法、冻干法等所以硬度和耐磨度较差。为了遮盖苦味也有采取明胶、微晶纤维素等包裹主药成小颗粒掩盖不适口味，再加甘露醇、矫味剂、崩解剂、润滑剂等以较小压力直接压片。50/273药典暂不收载是鉴于当前尚无适当质量标准作为崩解度测定方法，通常要求：1）口感好，在口腔中20-30秒以内崩解后无粗糙沙砾感。2）采取改进崩解度测定法溶出度测定通常采取常规溶出度测定法检验，同普通片。鉴于口崩片特点，在进行稳定性考查时必须将“口崩”项作为检察项目，加以确证。溶出度测定法参考：JP溶出度改良法、静置试管法、烧杯法、崩解仪法、滤纸法、润湿崩散法、其它方法1、静置试管法：玻管（直径1.5cm）、投入药片、加入37℃水2ml，静置，观察崩散情况。51/2732、烧杯法：烧杯一个（10ml，直径2cm，高35cm)加入药片,加入3ml，37℃水，计时,60s倒入复以1号筛烧杯中，应完全经过.必要时再加入5ml水快速冲洗，同法检验6片均应全部经过筛网崩解仪法：采取中国药典片剂崩解仪改造，降低移动速度，提升筛网细度。BP采取崩解仪法：NMT3分钟。关于脉冲片：脉冲片属于迟释制剂一个系指口服后不马上释放药品片剂，而在某种条件下如在体液中经过一定时间或一定pH值或一些酶作用下，一次或屡次突然释放药品片剂。如心脏病患者在半液易发病，睡前服用后可预防午夜或凌晨发病。国外报道FDA同意上52/273市哌甲酯脉冲片有精神兴奋作用，属于脉冲释药技术。每日早晨服用后4小时有一个释药高峰，方便学生用药。53/273

制药用水中总有机碳测定法（新增）

TOC基本概念TOC—总有机碳DOC—可溶性有机碳NPOC—难气洗有机碳POC—易气洗有机碳VOC—挥发性有机碳TIC（IC）—无机碳TC—总碳，是TOC和IC总和54/273水中有机碳起源自然界：动植物腐烂工业排放：石化，造纸，有机试剂农业：杀虫剂，化肥家庭：清洗剂，人畜排泄物55/273无机碳IC=CO2（水溶液）+HCO3-+CO32-（pH＜4.3）（pH＞10.3）CO2（液）二氧化碳水溶液HCO3-碳酸氢根CO32-碳酸根56/273USP及EP对水中TOC规范USP测试方法采取日期硫酸根1840钙离子 1840二氧化碳 1850氯离子 1890铵离子 1890易氧化物 1890重金属 1900总固体量 1947大肠菌 1947pH值 1970内毒素细菌 198357/273USP对水要求总有机碳总有机碳测定被确认为对纯化水（PW）和注射用水（WFI）可行测定方法，并被引入USP这个测定方法自1996年11月15日有效。从96/11/15起，TOC方法和易氧化物方法并存，可使用其中任何一个。58/273USP第23版中纯化水注射用水总有机碳方法于1998年5月15日起被正式起用USP-23版第八增版正式去除了易氧化物法59/273USP对水专题篇改进从前测试现在测试pH值1998年5月15日被删除内毒素细菌（BET）被保留钙电导率（1996年11月15日生效）硫酸根氯铵二氧化碳易氧化物1998年5月15日起被删除（必测TOC）重金属删除总固体删除大肠菌删除60/273欧洲药典（EP）采取了“快速、贯施”政策于1999年3月，EP第2.2.44章是采取了TOC方法TOC方法将于今年七月正式生效并将载入今年七月出版EP版EPTOC测试要求：对注射用水必须使用TOC法对纯化水可用TOC法，也可有易氧化物法61/273TOC方法优越性准确-氧化完全，由人或环境产生干扰小简单-操作方法简单自动化-可进行在线自动监测管理科学化TOC法对TOC测定仪要求必须使用经校准测定仪测定仪必须得经过系统适宜性试验62/273注射用水纯化水TOC测试频率一、隶属方面二、水质量方面1、取与易氧化物1、选择在线一样测试频率 2、水系统里含有代表2、通常是每一周性部位一次或每个月一次 3、应基于水系统工程3、对全部采样点进行验证和水质控制4、对有代表性采样点进行不停监测63/273注射用水纯化水TOC测试点“用来进行质量属性试验在线仪器可接收性取决于在水系统哪个部位采样。这些采样点和对应值必须反应在用水质量。”试验必须含有代表性，能代表全部使用点！64/273TOC测试技术全部TOC测定基本原理氧化物测定↓↓有机物→CO2→CO2一、氧化技术二、CO2测定技术1、高温氧化1、非分散红外探测（NDIR）2、加热过硫氧化2、直接电异率探测3、紫外线加过硫氧化3、薄膜电异率探测4、紫外线氧化5、紫外线加二氧化钛氧化65/273版《中国药典》药品微生物检验修订内容及背景

66/273

年版药典微生物程度标准修订情况

67/273一、年版微生物程度标准制订标准

：细菌数、酵母数和霉菌数按剂型制订；控制菌（致病菌）按给药路径制订。版：均按给药路径制订。

68/273二、年版微生物程度标准应用

本版药典明确指出：药品生产、贮存、销售过程中检验，原料及辅料（中药品标准复核，考查药品质量及仲裁等，除另有要求外，其微生物程度均以本标准为依据。

69/273三、年版微生物程度标准控制项目

杂菌数：细菌数霉菌和酵母菌数控制菌（致病菌）：大肠埃希菌

大肠菌群沙门菌

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

梭菌

70/273四、年版微生物程度标准分类

制剂通则、品种项下要求无菌制剂及标示无菌制剂

71/273五、制剂通则项下微生物程度要求

化学药制剂通则项下微生物程度要求无菌检验：注射剂、植入剂、冲洗剂。

标准性要求：丸剂、口服片剂、胶囊、颗粒剂72/273六、品种项下微生物程度要求

辅料：乳糖、淀粉、糊精、玉米朊、精制玉米油等。

纯化水：微生物程度

取本品，采取薄膜过滤法处理后，依法检验（附录XIJ），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。

注射用水：微生物程度取本品最少200ml，采取薄膜过滤法处理后，依法检验（附录XIJ），细菌、霉菌和酵母总数每100ml不得过10个。

73/273药典微生物程度检验法修订情况74/273微生物程度检验法起草指导思想：完善检验法。增加试验可操作性。使方法更具科学性，确保检验结果准确性。与国际接轨。75/273增、修订内容（1）-总则1操作环境洁净度：微生物程度检验应在环境洁净度10000级下局部洁净度100级单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格恪守无菌操作，预防再污染。洁净度定时检测：单向流空气区域、工作台面太环境应定时按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌测试方法》现行国家标准进行洁净度验证。76/273增、修订内容（1）-总则2霉菌、酵母菌培养温度为23~28℃。结果汇报：以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位汇报。77/273增、修订内容（2）-检验量随机抽取不少于检验量（两个以上最小包装单位）3倍。珍贵，微量样品检验量能够酌减。要求检验沙门菌供试品其检验量应增加10g或10ml。78/273增修订内容（3）-供试液制备1

表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证实其有效性及对微生物生长和存活无影响。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超出1小时。供试液制备若需用水浴加热时，温度不应超出45℃。供试液体积：100ml。79/273增、修订内容（3）供试液制备2供试品分类液体供试品固体、半固体或黏稠液性供试品需用特殊供试液制备方法供试品非水溶性供试品膜剂供试品肠溶及结肠溶制剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品具抑菌活性供试品80/273增、修订内容（3）供试液制备3非水溶性供试品：增加“十四烷酸异丙酯法”。结肠溶制剂供试品：用pH7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解。具抑菌活性供试品：增加方法可操作性。81/273增、修订内容（4）——灭菌培养基及稀释剂等灭菌：采取验证合格灭菌程序进行灭菌。82/273增、修订内容（5）——稀释剂稀释剂：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液pH6.8无菌磷酸盐缓冲液pH7.6无菌磷酸盐缓冲液83/273增、修订内容（6）-细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法：平皿法、薄膜过滤法按已验证计数方法进行供试品细菌、霉菌及酵母菌菌数测定。84/273细菌、霉菌、酵母菌计数-平皿法培养时间：必要时，可适当延长培养时间至5~7天。点计霉菌和酵母菌数。85/273细菌、霉菌、酵母菌计数-薄膜过滤法方法菌数汇报规则86/273增、修订内容（7）-控制菌检验（1）修订特点：降低篇幅不作详细生化试验要求增加判定方法适应微生物分类改变要求增加控制菌检验项87/273增、修订内容（7）-控制菌检验（2）修订检验法大肠埃希菌检验法、铜绿假单胞菌检验法、沙门菌检验法、金黄色葡萄球菌检查法。新增检验法大肠菌群检验法、梭菌检验法。88/273微生物程度检验用菌种、菌液制备及计数方法菌种要求：传代次数，保藏技术制备方法：液体培养物直接稀释法细菌标准浓度比浊法计数方法：平皿法菌液使用期89/273无菌检验法修订情况90/273无菌检验法特点药典附录无菌检验法较有较大改动；增加试验可操作性；方法更具科学性，提升检出率，确保检验结果准确性；缩小与先进国家药典无菌检验法差异。91/273增修订内容（1）—无菌检验试验环境

环境：试验应在洁净度10000级下局部洁净度100级单项流空气区域内或隔离系统中进行。

监测：应定时按《医药工业洁净（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法》现行国家标准进行洁净级检测。

隔离系统按相关要求进行验证，其内部环境洁净洁净度须符合无菌检验要求。

92/273增修订内容（2）—无菌试验用培养基培养基命名

培养基装量培养基适用性检验：无菌性检验，灵敏度检验。培养基贮藏

93/273增修订内容（3）——稀释液、冲洗液

0.1%蛋白胨水溶液

PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

94/273增修订内容（4）—灭菌

全部灭菌程序均应验证，方可采取。预防灭菌不彻底或过渡灭菌。

95/273增修订内容（5）——无菌检验方法验证

何时验证

验证用菌株选取择及要求

验证方法

结果判断

96/273增修订内容（6）——检验数量

明确原“最低检验量”是针对每种培养基。

修订了大致积注射剂、抗生素原料药、医疗器具批产品最低检验数量。要求同一品种用直接接种法与薄膜过滤法检验数量应一致，实际上是增加了上市抽验样品薄膜过滤法检验数量。

各容器样品装量不够接种两种培养基，应增加一倍检验数量。

97/273增修订内容（7）——检验量

另外要求了固体供试品检验量。

采取直接接种法时，若每支（瓶）供试品装量按要求足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，说明了检验量比版增加了一倍。

薄膜过滤法检验量应不少于直接接种法总接种量，只要供试品特征允许，应将全部容器内全部内容物过滤。

98/273增修订内容（8）——供试品无菌检验（1）

检验法选择：要求只要供试品性状允许，应尽可能采取薄膜过滤法。

供试品处理：详细描述了各类型供试品供试液制备法。

99/273增修订内容（8）——供试品无菌检验（2）

检验法：薄膜过滤法、直接接种法。

培养时间：版要求培养7天，版要求培养14天。

培养温度：改良马丁培养基置23~28℃培养。

100/273增修订内容（9）-结果判断

以一次检出为准,除非有证据充分证实检出微生物非供试品本身所致，原检验结果无效，可复试。修订理由：操作环境、试验条件改进；低污染供试品检出率问题。复试。

101/273增修订内容（10）——无菌检验法局限

本版药典无菌检验法指出：若供试品符合无菌检验法要求，仅表明了供试品在该检验条件下未发觉被微生物污染。

102/273鲎试剂与细菌内毒素检验法

103/273细菌内毒素检验相关理论及概念

细菌内毒素鲎试剂鲎试剂与内毒素反应机理细菌内毒素检验104/273名词解释

细菌内毒素检验法

热原检验法

LALTAL105/2731、细菌内毒素

细菌内毒素与热原关系热原指临床上能使哺乳类动物产生热原反应物质。细菌内毒素革兰氏阴性细菌细胞壁组成成份，含有各种生物活性，其化学结构是脂多糖（LPS）。热原与内毒素关系在学术上仍有争论，但在GMP条件下，，内毒素是主要热原物质，能够说无内毒毒就无热原，控制内毒素就控制热原。106/273细菌内毒素定义改变过去一直认为，细菌内毒素起源于革兰阴性细菌，但最近发觉非毒性革兰阴性LPS结构

全部内毒素均为脂多糖（LPS），但并非全部脂多糖均为内毒素，因为其不含有相关毒性。如：肽聚糖、葡聚糖。

107/273细菌内毒素定义改变尽管对内毒素，以及与LAL反应物质认识有了很大改变，但最终并没有改变作为当前LAL试验基础两个标准。

1）内毒素性与热原性相关，家兔和LPL试验作为人类和炎症反应预测方法二者相关。

2）在注射剂生产环境下，经过除外主要热原物质-内毒素而得以排除热原。

108/273细菌内毒素生物活性致热性

引发血液中粒细胞下降

激活凝血系统

血压下降

引发淋巴细胞有丝分裂

与鲎试剂反应

109/273细菌内毒素特征

广泛存在

非常稳定

其疏水末断非常易于本身或者与玻璃容器结合而聚集，而不是与水混合。

致热活性高度不均一性

110/273细菌内毒素参考品建立

不一样细菌内毒素对于鲎试剂反应活性不一样，为确保鲎试验平行性和重复性，要建立一个内毒素标准物质作为试验中控制标准。

因为大肠杆菌内毒素在天然内毒素中致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应灵敏性上处于中值位置，且其稳定，可溶，所以普通都采取大肠杆菌内毒素作为标准内毒素参考品。

111/273

标准内毒素与环境内毒素

标准内毒素：指经人工取提精制并经生物效价测定细菌内毒素，作为细菌内毒检验参考品。

标准内毒素包含参考标准品（RSE）、工作标准品（CSE）、其参考标准品又包含国际标准品（IS）和国家标准品（NS／RSE）。

112/273细菌内毒素量值

80年代以前以重量作为内毒素单位

1982年USP20引入以生物效价为量值内毒素单位（EU）113/273环境内毒素（EET）天然产生内毒素，普遍存在于水、空气中精制内毒素与环境内毒素差异：组成：精制毒素——脂、多糖环境内毒素——脂、多糖、蛋白质和杂质致热性：精制内毒素——致热性强环境内毒素——致热性较弱114/273细菌内毒素标准品稀释CP年版要求内毒素标准品溶解后国在旋涡混合器上混合15分钟，以后每一步稀释前地最少混合30秒，其它国家药典也类似国求；含有两极活性内毒素分子在水中展现不均匀分布不按要求进行旋涡混合会使所稀释内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确试验结果充分振荡后内毒素疏水端在水相中均匀分布；若静置一段时间，疏水端重新集成藏于器壁115/273世界上现存鲎种类鲎是一个海样无脊椎动物，蓝色血液。种类以及分布：美洲鲎：北美洲东岸海域中国鲎：中国东南沿海南方鲎：泰国和马来群岛海域圆尾鲎：东南亚西部海域116/273世界上现存鲎种类3种亚洲东海岸1种北美大西洋沿岸117/273鲎试剂与分类鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成鲎试剂种类：-依据鲎种类分：

•美洲鲎试剂（LAL）

•中国鲎试剂（TAL）

•圆尾鲎试剂（CAL）-依据检验方法分：

•凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂-依据内毒素和鲎试剂反应专一程度分：

•普通鲎试剂和特异性鲎试剂118/273BET目标和前提确保药品不含有能造成患者发烧反应发生足量细菌内毒素。一定量细菌内毒素能够被人体耐受，也是SFDA允许。前提是假定引发发烧反应热原几乎全部是内毒素。119/273细菌内毒素检验法凝胶法光度测定法浊度法（终点浊度法和动态浊度法）显色基质法（终点显色法和动态显色法）120/273凝胶法最简单、经济、应用最广泛，中国药典“仲裁”方法对干扰相对不敏感。有两倍误差较光度测定法不灵敏121/273药典细菌内毒素检验法修订内容结构上调整方法学上修改细节描述上修改122/273一、结构调整BP、USP25、JP14叙述是按试验步骤纂写，轻易了解，比较合理。各种溶液配制采取表格形式，直观易懂。检验法改变叙述次序，以及表格形式，这是两版药典细菌内毒素检验法区分最大地方。123/273以凝胶限量试验溶液制备为例A：供试品溶液B：供试品阳性对照C：阳性对照D：阴性对照编号内毒素浓度/配制内毒素溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检验用水2D无/检验用水2124/273与药典内毒素检验法整体结构

（分为检验法和指导标准）

检验法（凝胶法）介绍试验准备鲎试剂灵敏度复核试验供试品干扰试验细菌内毒素检验法（凝胶法和光度法）介绍试验准备供试品溶液制备细菌内毒素限值确实定确定最大有效稀释倍数（MVD）125/273与药典内毒素检验法整体结构

（分为检验法和指导标准）

检验法结果判断定方法一：凝胶法鲎试剂灵敏度复核干扰试验检验法：1）凝胶限量试验2）凝胶半定量试验126/273与药典内毒素检验法整体结构

（分为检验法和指导标准）

细菌内毒素检验法应用指导标准细菌内毒素限值确实定细菌内毒素定量测定法（浊度法和显色基质法）试验准备标准曲线可靠性试验定量法干扰试验供试品定量测定方法二、光度测定法标准曲线可靠性试验干扰试验光度法检验法127/273二、方法学上修改1、药典中只收载凝胶法，定量法只作为指导标准一部分收载。将指导标准合并入检验法中，正式收载细菌内毒素定量检测法（光度法）。128/273方法学上修改修改原因检验法为凝胶法指导标准中收载定量法。两种方法：凝胶法和光度测定法。可使用其中任何一个方法，当测定结果有争议时，除另有要求外，以凝胶法结果为准定量法发展日趋成熟，能够广泛使用，故将凝胶法和定量法合并收载。同时因为“凝胶法”和“光度法”是以检测原理命名，“定量法”时相对于“定性”，所以，将“定量法”改为“光度测定法”更为妥当。129/2732、增加了凝胶法半定量法修改原因凝胶法为凝胶限量法：判断供试品中细菌内毒素限量是否符合要求一个方法。凝胶法分为：凝胶限量试验判断供试品中细菌内毒素限量是否符合要求一个方法。凝胶半定量试验本方法系经过确定终点浓度来量化供试品溶液中内毒素试验。即使半定量法在我国使用不多，不过因为半定量法在其它国家应用广泛，许多进口药品申报材料及进口复核都要求使用凝胶半定量法，所以添加此方法，与国际接轨。130/2733、将凝胶法干扰试验中供试品对照管由2支增加为4支，鲎试剂标示灵敏度对照系列保持4支。修改原因凝胶法干扰试验中：供试品对照管2支。鲎试剂标示灵敏度对照系列每一浓度平行4支。凝胶法干扰试验中：供试品对照管4支。鲎试剂标示灵敏度对照系列每一浓度平行4支。协调案中要求供试品对照管4支，鲎试剂标示灵敏度对照系列每一浓度浓度平2支试管。考虑到当前鲎试剂质量各厂家存在差异。131/2734、将凝胶法中各种对照数量由1支增加为2支。修改原因凝胶法中：每批供试品需做2支供试品管，1支供试品阳性对照，1支阳性对照和1支阴性对照，共5支。凝胶法中：每批供试品需做2支供试品管，2支供试品阳性对照，2支阳性对照和2支阴性对照，共8支。考虑至对照是试验是否成立标准，所以将各种对照增加为2支。132/2735、光度法试验中几点改动修改原因标准曲线可靠性试验：用标准内毒素配成溶液并制并制成最少3个等比系列稀释液（稀释度为2~10），设为、λ1、λ2……λn（n≥3），其中λ1为标准曲线最低内毒素浓度。标准曲线可靠性试验：用标准内毒素配成溶液并制并制成最少3个等比系列稀释液（稀释度不得大于10），最低浓度不得供于所用鲎试剂标示检测限。因为制备标准曲线时不一定非是等比系列，所以去掉了对于等比系列稀释液要求。另处，国际上对于光度法标准曲线中各点浓度不再使用λ1、λ2……λn概论，而只对其最低浓度称为λ。133/2735、光度法试验中几点改动修改原因光度法阴性对照要求为：当阴性对照结果不超出λ1时，将全部数据进行线性回归分析。光度法阴性对照要求为：当阴性对照在设定反应时间内不发生反应，将全部数据进行线性回归分析。使阴性对照控制更为严格。134/2735、光度法试验中几点改动修改原因光度法干扰试验中，在回收试验里添加内毒素量为：λm，λm为标准曲线中最低浓度λ1和最高浓度λn（n≥3）间中间浓度光度法干扰试验中，在回收试验里添加内毒素量为：标准曲线中点（或附近点）浓度（设为λm）。因为考虑到标准曲线上浓度数如为偶数上浓度数如为偶数则不存在中间点，所以改为“标准曲线中点（或附近点）更为合理。135/273三、细节描述上修改136/2731、因为药典将凝胶法与光度测定法同时收载，所以在介绍中对凝胶法和光度法都进行了描述。而且也将两种方法试验准备及限值确实定一同叙述。2、因为药典中对于细菌内毒素工作标准品要求“细菌内毒素工作标准品中，每1ng细菌内毒素效价应大于2EU，小于50EU”为生产要求，并不针对用户，在中删除对工作品此项标准。3、因为考虑到供试品溶液中pH值等原因对试验影响，故在增加了“供试品溶液制备”项，并对供试品pH值提出了要求。4、因为将凝胶法与光度法一同收载，所以也将原来分开叙述最大有效稀释倍数（MVD）计算方法合并。137/2735、在干扰试验中，添加了“为确保所选择处理方法能有效排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标内毒素再经过处理供试品溶液进行干扰试验”。6、在光度测定法中，要求“供试品各鲎试剂加样量、供试品和鲎试剂百分比以及保温时间等，参考所用仪器和试剂相关说明进行。每种溶液最少做2个平行管。”138/273《中国药典》细菌内毒素检验法介绍139/273整体结构一、综述部分检验法描述试验准备限值（L）确实定确定最大有效稀释倍数（MVD）二、试验部分1、凝胶法2、光度测定法a、鲎试剂灵敏度复核a、标准曲线可靠性试验b、干扰试验b、干扰试验c、检验法：限量试验c、检验法半定量试验140/273一、综述部分检验法描述试验准备限值（L）确实定确定最大有效稀释倍数（MVD）141/2731、检验法描述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素限量是否符合要求一个方法。细菌内毒素检验包含两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包含浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一个方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有要求外以凝胶法结果为准。细菌内毒素标准物质国家标准品工作标准品142/2731、检验法描述细菌内毒素检验用水凝胶法细菌内毒素检验用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml灭菌注射用水。光度测定用细菌内毒素检验用水，其内毒素含量应小于0.005EU/ml。143/2732、试验准备试验器械要求试验所用器皿需经处理，以去除可能存在内毒素。惯用方法是在250℃干烤最少60分钟，也可采取其它确证不干扰细菌内毒素检验适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板与微量加样器配套吸头等，应选取标明无内毒素而且对试验无干扰器械。试验操作过程应预防微生物污染。144/2732、试验准备供试品溶液制备一些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。普通要求供试品溶液pH值在6.0~8.0范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力供试品，需调整被测溶液（或其稀释液）pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐适宜缓冲液调整pH值。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。145/2733、限值（L）确实定药品、生物制品细菌内毒素限值（L）普通按以下公式确定：L=K/M按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可依据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。计算举例：注射用阿莫西林钠依据国家药典委员会编纂《临床用药须知》：“肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次0.5~1g，一日3~4次：小儿按体重每日50~100mg/Kg，分3~4次静脉滴注。”M成人=1000mg/h÷60Kg=16.67mg/(Kg•h)M成人=100mg/(Kg•h)÷3=33.3.mg/(Kg•h)L=K/M=5EU/(Kg•h)÷33.3.mg/(Kg•h)=0.150EU/mg146/2733、限值（L）确实定限值计算时做必要调整几个情况从严标准联适用药特殊情况等147/2734、确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指供试品溶液被充许稀释最大倍数，在不超出此稀释倍数浓度下进行内毒素限值检测。MVD=cL/λL：供试品细菌内毒素限值C：供试品溶液浓度λ：在凝胶法中鲎试剂标示灵敏度（EU/ml),或是在光度测定法中所使用标准曲线上低内毒素浓度。（如标准曲线为50、5、0.5EU/ml三个浓度组成）148/2734、确定最大有效稀释倍数（MVD）计算举例：a、当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml适合用于供试品为状态，而且要求限值为应小于xxEU/ml。例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml鲎试剂进行检验，则MVD=1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍b、当L以EU/mg或EU/U表示时，浓度c单位需为mg/ml或U/ml。适合用于供试品为固体状态，如粉针；或液不过要求限值为应小于xxEU/mg或EU/U。149/273例：注射用阿莫西林钠计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml鲎试剂进行检验。需先称取一定重量注射用阿莫西林钠，在已除去外源性内毒素容器中，用细菌内毒素检验用水配制成一定浓度溶液。如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml内毒素检验用水溶解，即成为浓度为20mg/ml阿莫西林钠溶液。MVD=20mg/ml×0.15EU/mg÷0.125EU/ml=24倍150/2734、确定最大有效稀释倍数（MVD）如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品最小有效稀释浓度c=λ/L；适合用于供试品为固体情况。计算得到最小有效稀释浓度即为MVD下该供试品浓度。例：注射用阿莫西林钠计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml鲎试剂行检验。最小有效稀释浓度C=0.125EU/ml÷0.15EU/mg=0.833mg/ml151/273二、试验部分1、凝胶法2、光度测定法a、鲎试剂灵敏度复核a、标准曲线可靠性试验b、干扰试验b、干扰试验c、检验法：限量试验c、检验法半定量试验152/273鲎试剂灵敏度复核试验□试管○阴性●阳内毒素浓度2λλ0.5λ0.25λ阴性对照鲎试剂平行管□□□□□□□□□□□□□□□□□□153/273鲎试剂灵敏度复核试验放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180o，若管内形成凝胶，而且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；形成凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应防止受到振动造成假阴性结果。154/273鲎试剂灵敏度复核试验结果判断：若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。结果计算：反应终点浓度几何平均值，即为鲎试剂灵敏度测定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）式中X为反应终点浓度是指系列递减内毒素浓度中最终一个呈阳性结果浓度。155/273鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度2λλ0.5λ0.25λ阴性对照终点

鲎试剂平行管●●○○○λ●●○○○λ●●●○0.5λ●●●○0.5λλc=lg-1(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)4=0.707λ156/273 鲎试剂灵敏度复核试验当λc在0.5λ~2λ(包含0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检验。试验时，以标示灵敏度λ为该批鲎试剂灵敏度。157/273凝胶法干扰试验目标：是确定供试品在多大稀释倍数或浓度下对同位毒素和鲎试剂反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检验法提供依据。158/273凝胶法干扰试验造成干扰原因：pH值抗凝因子螯合剂葡聚糖……凝胶法干扰试验稀释中和过滤加热……159/273凝胶法干扰试验预试验目标：初步确定供试品最大不浓度（当限值以EU/mg或EU/u活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰试验提供依据。优点：降低探索过程、节约成本将供试品溶液进行一系列倍数稀释。使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即含2.0λ浓度标准内毒素该浓度供试品稀释液）。加做2支阴性对照，和2支阳性对照。160/273凝胶法干扰试验预试验MVD0.5MVD0.25MVD0.125MVD0.06MVD0.03稀释倍数原液5倍10倍20倍40倍供试品溶液□□□□□□□□□□PPC□□□□□□□□□□NC□□PC□□161/273凝胶法干扰试验预试验——结果判断当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，试验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验。162/273凝胶法干扰试验预试验○阴性●阳性如上结果可初步确定该样品最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰试验。普通提议：40倍稀释倍数原液5倍10倍20倍40倍供试品溶液○○○○○○○○○○PPC○○○○○●●●●●NC○○PC●●163/273凝胶法干扰试验正式干扰试验目标：检验在某一浓度下供试品对于鲎试剂与内毒素反应有没有干扰作用。操作：用内毒素检验用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度内毒素溶液。同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。按表1制备溶液A、B、C和D164/273编号内毒素浓度/配制内毒素溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素浓度平行管数A无/供试品溶液---2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/检验用水检验用水12λ421λ440.5λ480.25λ4D无/检验用水---2165/273凝胶法干扰试验正式干扰试验结果判断：当供试品阴性对照A和阴性对照D结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。分别计算用检验用水制成内毒素标准溶液反应终点浓度几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成内毒素溶液反应终点浓度几何平均值（Et）。Es=lg-1(∑Xsλ/4）Et=lg-1(∑Xtλ/4）当Es在0.5~2λ(包含0.5λ和2λ）及Et在0.5~2λ(包含0.5λ和2λ）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。166/273内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ内毒素/检验用水（系列溶液C）

□□□□□□□□□□□□□□阴性对照（溶液D）□□内毒素/供试品溶液（系列溶液B）□□□□□□□□□□□□□□□□供试品阴性对照（溶液A）□□167/273内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ终点内毒素/检验用水（系列溶液C）

●●○○λ●●○○λ●●○○λ●●○○λ阴性对照（溶液D）○○内毒素/供试品溶液（系列溶液B）●●○○λ●●○○λ●○○○2.0λ●○○○2.0λ供试品（溶液A）○○Es=lg-1(∑Xsλ/4）=λEt=lg-1(∑Xtλ/4）=1.41λ168/273凝胶法干扰试验正式干扰试验当存在干扰时，可经过对供试品进行更大倍数稀释或经过其它适宜方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择处理方法能有效排除干扰且不会使内毒素失支活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理供试品溶液进行干扰试验。即，先在供试品溶液中添加2λ浓度标准内毒素，然后用所选择方法处理溶液，而后再进行稀释、检测。169/273凝胶法干扰试验正式干扰试验当