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项目17-5溶菌酶的活力测定

1．原理溶菌酶能催化水解黏多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）β-1，4-糖苷键。几丁分子结构与其相似，能为溶菌酶水解。

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1．原理几丁为不溶性物，不能直接用于活力测定。用环氧乙烯活化其糖环上的6位上的羟基，使几个转变为水溶性几丁（G·ch），然后以RBB-G·ch为底物，经溶菌酶作用水解底物，释放出染料标记碎片，除去未作用的底物后，以其溶液颜色的深浅可表达酶的活性大小，从而可在600nm波长处直接比色测定酶活力。

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2．底物的制备(1)乙二醇化几丁（G·ch）准确称取5g几丁置于玻璃烧杯中，逐渐加入浓氢氧化钠溶液（43%）100～150mL，搅拌均匀后，在室温下真空放置24h，然后用2号砂芯漏斗抽滤除去碱液，得到碱化几丁约25g。

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2．底物的制备将碱化几丁放入250mL烧杯中，再逐渐加入冰屑（约120g）混合，使之分散成水饴状透明黏液，然后用适量浓氢化钠溶液调节至含13%氢氧化钠为止。在烧杯中，加入环氧乙烷5g，搅匀后静置24h，然后再搅拌1.5h，完成乙二醇化，得到亮黄色水饴状乙二醇化几丁透明黏液。

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2．底物的制备将此液转入1000mL大烧杯中，搅拌下缓缓加入丙酮、乙醇混合液（1:9）600mL，搅拌1h后，于离心机上离心，收集沉淀，再用90%的乙醇洗涤沉淀，离心，洗涤，至膨润液的pH为8～9，然后依次用乙醇、无水乙醇洗涤。最后用乙醚干燥，得到白色粉状水溶性乙二醇化几丁。

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2．底物的制备(2)标记乙二醇化几丁取3g乙二醇化几丁干烧杯中，加150mL蒸馏水使之膨润，搅拌后移入三劲瓶中，50℃保温。搅拌下，加入RBB溶液20mL，然后加3～5g无水硫酸钠和磷酸钠，连续反应3～5h，取出，冷却至室温。搅拌下加入90%乙醇600mL，离心收集沉淀，反复膨润，最后用乙醚干燥得到深蓝色标记乙二醇化几丁粉末。

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3．测定方法(1)底物溶液取1gRBB-G·ch于烧杯中，加入0.1mol/L、pH4.5的醋酸缓冲液100mL，搅拌30min，离心得到深蓝色透明溶液。

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3．测定方法(2)溶菌酶标准溶液准确称取试剂溶菌酶，溶解于0.1mol/L、pH4.5的醋酸缓冲液中，配成0.6mg/mL标准溶液。然后稀释为不同浓度，用以制作溶菌酶标准曲线。将6支装好溶液的试管，置离心机中离心后取每管上清液，于600nm处比色，以底物含量为横坐标、光吸收值为纵坐标做图，绘制标准曲线。

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3．测定方法(3)测定样品①样品溶液配制：称取一定量的样品，用0.1mol/L、pH4.5的醋酸缓冲液配制成0.2mg/mL溶液。②样品测定：取底物溶液1mL，40℃预热，然后加样品液0.5mL，准确反应30min后，加5mL酸乙

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