项目17-4 柱层析结晶法提取溶菌酶

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

1.

提取原理捣碎后的鸡蛋壳膜经过低浓度的盐溶液处理后，溶菌酶即被抽出来。由于溶菌酶在酸性条件下具有较好的耐热性，而且又具有较高的等电点，因此可以用热变性与等电点沉淀下结合的方法除去抽提液中的大部分杂蛋白；再利用溶菌酶在酸性条件下能与聚丙烯酸结合形成凝聚物，而当有钙离子存在时溶菌酶又能从这种凝聚物中分离出来的特性，将抽提液进行纯化和浓缩；然后利用柱层析将浓缩液进行分离纯化；最后，利用结晶和重结晶的方法制得溶菌酶晶体。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

2.

主要药品1%氯化钠-0.05mol/L盐酸溶液：称取氯化钠5g，先以少量蒸馏水溶解，再加2mol/L盐酸12.5ml，最后加水定容至500ml10%聚丙烯酸：按每10g聚丙烯酸加蒸馏水90ml，临用时配制。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

3．加工技术要点(1)装柱称取市售阳离子交换树脂CM-Sephadex若干，加入适量蒸馏水溶胀8h左右，溶胀过程中应轻轻搅拌几次以便于溶胀结束后去除漂浮物及杂质。再用新配制的相当于树脂体积4倍的2mol/L氢氧化钠溶液浸泡数小时后，用蒸馏水冲洗至中性，然后装柱（柱的大小视加工规模而定）。并用0.6%的氯化钠溶液若干唷过平衡装柱过程中注意切勿让空气进入形成气泡。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

3．加工技术要点(2)抽提称取新鲜鸡蛋壳若干，将其彻底捣碎后置于瓷盆内，加入其1倍体积量的1%氯化钠-0.05mol/L盐酸溶液并间歇搅拌，以便抽提顺利进行。测试混合液的PH是否6为，如过高或过低，则应分别用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节。向滤渣中再加入其半倍体积量的1%氯化钠-0.05mol/L盐酸溶液重复抽提1~2次，合并滤液。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

3．加工技术要点(3)除杂蛋白测定上述滤液的PH是否为4.5，如若不是，则视具体情况用稀酸或稀碱调节到PH4.5左右。预先准备好沸水浴，将滤液置于沸水浴中迅速升温至75℃左右，全过程3min左右完成。在此条件下溶菌酶不易变性而其它蛋白质则不然。用冷水冷却后高速离心15min（如无离心设备，亦可静置数小时后再过滤并收集起滤液）其沉淀物为热变性杂蛋白。而溶菌酶则仍在上清液中，收集起上清液供下步使用。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

3．加工技术要点(4)浓缩量出上清液的体积。边搅拌边缓慢加入约为上清液体积1/4的浓度为10%的聚丙烯酸，则可发现有凝聚物出现。凝聚物出现后便很快沉淀并粘附于容器底部。静置半小时后，倾掉上清液，缓慢加入少量0.5mol/L碳酸钠溶液使凝聚物充分溶解，然后边搅拌边缓慢加入适量的氯化钙溶液（体积约为聚丙烯酸量的1/12），片刻后过滤，将沉淀物压干后另用，收集起滤液。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

3．加工技术要点(5)柱层析量出上述滤液的体积，向滤液中缓慢加入氯化钠粉末，使氯化钠的最终浓度达5%，并边入边搅拌以促使其迅速溶解，然后慢慢地将此液加入CM-Sephadex柱中，上柱完毕后用0.6%的氯化钠洗脱液洗脱，收集起洗脱液直到溶菌酶全部从柱上洗脱为上。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

3．加工技术要点(6)结晶和重结晶上述洗脱液中主要成分为较高线纯度的溶菌酶。用2mol/L的氢氧化钠溶液将此洗脱液的pH调节到10。按溶液体积加入氯化钠粉霜使成5%浓度，再加入少量的溶菌酶晶体作为晶种后，将其置于冰箱内，在0～4℃的条件下进行结晶，等晶体结晶完全后减压抽滤并收集起结晶，此结晶经放有五氧化二磷及石蜡的真空干燥器中干燥后即得溶菌酶成品，低温下保存等待出售。职认为纯度不中，可利用重结晶的方法进一步提纯。

项目17-4柱层析结晶法提取溶菌酶

4．注意事项第四步中生成的沉淀物主要成分为聚丙烯酸钙，可用于回收聚丙烯酸。其具体做法是，将此沉淀物加入适量的硫酸溶液中，片刻后滤去硫酸钙沉淀，便得聚丙烯酸溶液；为了提高酶的浓度以利结晶生成，可利用透析法将洗脱液浓缩，具体做法是，将洗脱液装入透析袋内

，置于装有聚乙二醇的容器中，酶液中的