蛋白质分离纯化

第七章蛋白质的分离

纯化和表征

第一节

蛋白质的酸碱性质

第二节蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀

第三节蛋白质分离纯化的一般原则

第四节蛋白质混合物的分离方法

第五节蛋白质分子量的测定第六节蛋白质含量的测定与纯度鉴定

第一节蛋白质的酸碱性质蛋白质是两性电解质，是多价的。解离基团——侧链基团（主要），末端α—COOH和α—NH3（次要）

。蛋白质的等电点（pI）等离子点第二节蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀水化层和双电层影响蛋白质沉淀的因素沉淀蛋白质的方法：盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法重金属盐沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法加热变性沉淀法第三节蛋白质分离纯化的一般原则纯化的最终目标：增加纯度或比活性，并使产量达到最高值。

前处理粗分级细分级

第四节蛋白质混合物的分离方法利用溶液度差别的分离方法根据分子大小不同的分离方法根据电荷不同的分离方法蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用利用溶液度差别的分离方法1.等电点沉淀：（isoelectricprecipitation）2.蛋白质的盐溶和盐析（Saltingout）3.有机溶剂分级法：4.温度对蛋白质溶解度的影响：二.根据分子大小不同的分离方法透析（dialysis）和超过滤（ultrafiltration）：密度梯度（区带）离心：凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析）（gelfiltration）

：

透析（dialysis）UltracentrifugationGelfiltrationchromatography葡聚糖凝胶过滤三.根据电荷不同的分离方法离子交换层析：

电泳：

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

（等）电聚焦（IEF）：

离子交换层析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺增速剂：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小（等）电聚焦（IEF）：蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用亲和层析（Affinitychromatography）吸附分离

疏水层析

AffinitychromatographyHighPressureLiquidChromatography第五节蛋白质分子量的测定方法：根据化学组成测定最低分子量利用凝胶过滤法测定分子量公式：Ve－Vo=a－b

logM

logM=K1－K2Ve

利用SDS—PAGE法测定分子量公式：

logM=K1－K2μR

4.质谱法5.通过渗透压测定蛋白质分子量第六节蛋白质含量的测定与纯度鉴定含量：凯氏定氮法（Kjeldahl）

双缩脲法（biuret）Follin—酚法（Lowry）紫外吸收法染料结合法（Bradford）BCA法：ROOOOOOOOHHHHHHHHHHH+NNNNNNNNNCCCCCCCCCCCCCCCCCCOO-RRRRRRRR1BiruetMethods(carbonyl)2Cu+Phosphomolybdic-phosphotungstateCOH..LowryMethods280nm(aromatic)CoomassieBrilliantBlueG-N=N--NH--OH-SO3-SO3-SO3--N=N--NH--OH-SO3-SO3-SO3-■各种蛋白质定量法原理：■各种蛋白质定量法原理：TyrUVAbsorbanceCu2+Cu+34CoomassieBrilliantBlueG-250加入蛋白质酸性环境下呈茶色

CBG是一种指示剂470nm595nm

BradfordMethod：精

确准确不精

确+不准确280nm吸光度BiuretMethodLowryMethodBradfordMethod原理图：BCA分子式：纯化过程中需要测定：总蛋白，总活力，比活力，