遗传学第五章基因组

遗传学第五章基因组基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体。

基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体所包含的DNA分子以及DNA分子所携带的全部遗传指令。人类基因组：22条常染色体和X、Y染色体的DNA组成。

基因组第2页,共51页，2024年2月25日，星期天

生物体单倍体DNA总量称为C值。

C值最大最小相差10万倍。

C值同生物进化是什么关系？一、C值悖论和序列复杂性§1、

C值悖理（C-valueparadox）第一节基因组DNA序列组成第3页,共51页，2024年2月25日，星期天基因组大小

种类Mb大肠杆菌4.64啤酒酵母12.1线虫100.0果蝇140.0蝗虫5000.0小鼠3300.0豌豆4800.0玉米5000.0小麦17000.0

人3000.0

第4页,共51页，2024年2月25日，星期天霉菌藻类G+细菌G-细菌显花植物鸟类哺乳类爬行类两栖类硬骨鱼类软骨鱼类赖皮类甲壳类昆虫类软体动物蠕虫类真菌枝原体A生物体进化程度高低与大C值不成明显正相关B亲缘关系相近的生物大C值相差较大C同一类生物内大C值与小c值相差极大（Euk.人体c=C/10）

(Prok.Φx174c＞C)

第5页,共51页，2024年2月25日，星期天

在同一类生物中，不同种的基因组大小也有很大差别。C值悖理，从总体上说，生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位高低无关，这种现象称为C值悖论。第6页,共51页，2024年2月25日，星期天§2、序列复杂性在同一类生物中，不同种的基因组大小悬殊差别。主要差别在于“多余”（excess）DNA的量的差别。“多余”DNA量多，则基因组大；“多余”DNA量少，则基因组小。“多余”DNA主要是重复序列。序列复杂性:不同序列的总长度称为序列复杂性,用bp表示。

140bp:(1)20bp,30bp,40bp,50bp20+30+40+50=140bp(2)70bp(2个拷贝)70=70bp序列复杂性高低反映了序列包含的遗传信息量的大小。生物体基因组的复杂程度还表现在基因的外显子数目的多寡。第7页,共51页，2024年2月25日，星期天二、基因组DNA序列的分类1、编码序列和非编码序

编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。非编码序：内含子和基因的间隔序列。2、单一序列和重复序列

单一序列：基因组中只有一份的DNA序列。重复序列：基因组中重复出现的序列。如STR,微卫星DNA等第8页,共51页，2024年2月25日，星期天重复序列高度重复序列。几百---几百万个拷贝。Alufamily轻度重复序列。2—10个拷贝。中度重复序列。10—几百个拷贝。rDNA、tDNA原核生物基因组几乎不含重复序列；低等真核生物基因组中，中度重复和高度重复序列不超过20%；动物细胞基因组中，中度重复和高度重复序列约占50%；显花植物和两栖动物基因组中，中度重复和高度重复序列几乎可达80%重复序列第9页,共51页，2024年2月25日，星期天三、DNA复性动力学●

D.S.DNAS.S.DNA

(加温,极端pH)

▼Renaturation

复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞

(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)

第10页,共51页，2024年2月25日，星期天影响复性的因素：真核生物：第1组分（25%），快，高度重复序列；第2组分（30%），中，中度重复序列；第3组分（45%），慢，单一或少拷贝；

温度时间离子强度

DNA片段大小

DNA序列复杂性

DNA分子浓度第11页,共51页，2024年2月25日，星期天四、重复序列家族重复序列家族:是指一类核苷酸序列高度相似的重复序列，这些重复序列包括基因和基因以外的序列。基因家族:真核生物基因组中来源相同，结构相似、功能相关的一组基因可归为一个基因家族。基因家族可归入重复序列家族，但不是其主要组成，主要组成基因以外的序列。第12页,共51页，2024年2月25日，星期天散在重复序列散在重复序列：散在的方式分布于基因组内的重复序列。

短散在重复序列（SINEs）,500bp长散在重复序列（LINEs）,1000bpAlu序列家族：人类50-70万拷贝；人和灵长类基因标志。多聚（dT-dG）家族：10万拷贝第13页,共51页，2024年2月25日，星期天基因组学结构基因组学功能基因组学基因和基因组的结构各种元件的序列特征基因作图和基因定位不同序列结构具有不同功能基因表达的调控基因与环境相互作用转录物组学蛋白质组学表型组学第二节基因组研究第14页,共51页，2024年2月25日，星期天一、人类基因组研究1986[美]Dulbecco首次提出了“人类基因组工程”1990.4月美国宣布人类基因组测序工作的5年计划。2001.1.12中、美、日、德、法、英等国科学家（Nature,15日)和美国塞莱拉公司(Science,16日)各自公布人类基因组图谱和初步分析结果。约3万基因。我国参与研究的第3号染色体，共计3000万个碱基对，约占人类基因组全部序列1%（1999.9月加入这一研究计划）。第15页,共51页，2024年2月25日，星期天1、遗传图：遗传图以染色体上某一点为遗传标记，以与之相伴遗传的特征为对象，通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定它们的相对距离(单位：cM,厘摩)；2、物理图：以特定的DNA序列为标界，将各种标记直接定位在基因库中的某一点上。物理图上标界之间的距离以物理长度来表示，即以核苷酸对的数目来表示（单位：bp,kb）；3、序列图：核苷酸组成的基因组全部DNA序列。4、基因图：测定这些可表达片段（EST）的标记图。人类基因组框架图第16页,共51页，2024年2月25日，星期天人类基因组计划（HGP）遗传图物理图序列图基因图基因定位

基因克隆

基因转移

比较基因组研究物种的起源与进化基因的证实与克隆生物学的发展水稻等作物基因组计划猪，牛等家畜基因组计划第17页,共51页，2024年2月25日，星期天二、基因定位和作图§1、基因标记和作图界标基因标记：利用可鉴别的形态、生化等表型性状作标记。如：血型、蛋白质氨基酸、等位基因等图谱标记：可用基因或DNA作为可鉴别的标记(marker)。基因标记和DNA的分子标记。分子标记：特定DNA序列构建遗传图谱的标记。

每种生物DNA具有稳定性。第18页,共51页，2024年2月25日，星期天

（1）RFLPrestrictfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性（2）SSLPsimplesequencelengthpolymorphism简单序列长度多态性

（3）SNPsinglenucleotidepolymorphism

单核苷酸多态性

（4）STS/EST非多态的短单一序列作为标界DNA的分子标记RAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA随机扩增多态性AFLP

amplifiedfragmentlengthpolymorphism

扩增片段长度多态性第19页,共51页，2024年2月25日，星期天如一对同源染色体二个DNA分子，一个具有某种酶的酶切位点，另一个无此位点

酶切后形成的DNA片段长度就会有差异，即多态性(RFLP)

根据该等位基因的遗传，将RFLP作为标记定位在基因组的某一位置上。限制性内切酶多态性:限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列，DNA序列能或不能被某一酶酶切，实际上相当于一对等位基因的差异。（1）

RFLP限制性片段长度多态性第20页,共51页，2024年2月25日，星期天（2）

简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymor-phisms,SSLP)简单序列长度多态性,又称为VNTR

variablenumbertandemrepeat

数目可变的串联重复多态性。指重复单位相对较小,由重复单位的序列差异和数目变化,可形成丰富的多态性。

包括:小卫星序列、微卫星序列。小卫星序列(microsatellite):又称简单重复序列(STRs)，常只有2~4个核苷酸重复单位。微卫星(minisatellite)也称多次重复序列(VNTR)，重复序列长度为几十个核苷酸。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，据串联重复排列微卫星基序两侧的单一序列可以人工合成引物,对微卫星序列（microsatelliteDNA或simplesequencerepeats，SSR）进行扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来,由微卫星基序重复数目的变异而产生多态性。第21页,共51页，2024年2月25日，星期天随机扩增片段长度多态性DNA，简称RAPD技术，是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度降至35℃左右。与其他标记相比,RAPD具有以下优点：①不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物的分析。②操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖的分析。③不需制备探针、杂交等程序，成本较低。④DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析）,允许快速、简单地分离DNA。已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。RAPD是一种显性标记,分离群体中纯合体和杂合体通过后代才能区别，并且由于该技术采用的是随机引物扩增，扩增结果的稳定性较差，这在一定程度上限制了其发展。（3）随机扩增片段长度多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD

）第22页,共51页，2024年2月25日，星期天AFLP是指通过PCR扩增经限制性内切酶酶切后的基因组DNA模板产生显示多态性的DNA片段。这一方法最初是在1992年由荷兰一家私人公司提出的。其原理和步骤大致为：将基因组DNA用限制性内切酶酶切成片段，在DNA片段两端连接上一段已知序列，再以该已知序列为基础，加上2~3个随机变化的核苷酸序列设计引物，进行PCR扩增和进一步检测。AFLP技术是在RAPD技术基础上，结合RFLP技术产生的。由于AFLP引物的特异性比RAPD的随机引物强，从而克服了RAPD重复性差的问题，还可以通过增减引物的长度来控制PCR扩增带型的复杂程度。这一方法的缺点是技术操作较为复杂、成本也较高。对基因组DNA进行双酶切，形成分子量大小不同的随机限制片段，再进行PCR扩增，根据扩增片段长度的多态性的比较分析，可用于构建遗传图谱、标定基因和杂种鉴定以辅助育种。

（4）扩增片段长度多态性分析

第23页,共51页，2024年2月25日，星期天DNA指纹图谱第24页,共51页，2024年2月25日，星期天主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）氯吡格雷(抗凝药)

第25页,共51页，2024年2月25日，星期天§2、基因定位(1)植物基因定位：借助基因标记和DNA的分子标记，可使基因定位在精度、深度、广度等方面有极大的提高。已陆续在一些农作物上定位了许多重要农艺性状和经济性状的基因，在复杂数量性状位点(quantitativetraitloci，QTL)定位分析方面，也取得了很大进展。第26页,共51页，2024年2月25日，星期天

中断杂交实验(min)：

F+

×F–

Hfr×F–（2）细菌的基因定位第27页,共51页，2024年2月25日，星期天（3）人类家系分析定位

Y染色体X染色体常染色体：

第28页,共51页，2024年2月25日，星期天（4）原位杂交定位DNA或RNA分子探针

放射性标记分子杂交显影/显色基因定位第29页,共51页，2024年2月25日，星期天（1）酶切完全酶切部分酶切§3、序列图作图（1）酶切（2）叠连群建立（3）序列测定第30页,共51页，2024年2月25日，星期天（2）叠连群建立第31页,共51页，2024年2月25日，星期天（3）序列测定①DNA测定的酶法，②化学测序法③DNA自动测序第32页,共51页，2024年2月25日，星期天DNA测定的酶法：即Sanger法、终止法、双脱氧法

DNA聚合酶，单链DNA模板，引物复性后分4份加4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和

dCTP），其中一种为α-32P标记各加一种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）,3’

缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱直接读得DNA的碱基序列序列测定方法之一AGTTGCTA第33页,共51页，2024年2月25日，星期天化学测序法又称Maxam-Gilbert法序列测定方法之二把待测序的DNA分子成单链分子，其5’端用32P进行放射性标记。分成4份，每份用一种化学试剂处理DNA片段，每种试剂可使DNA分子在一种碱基的5’端的磷酸二酯键处发生断裂。使每个DNA分子只发生一次断裂。把这4种反应产物用聚丙烯凝胶电泳进行分离，用X光胶片进行曝光，得到一张由不同条带组成的序列图。从图上就可以读出待测DNA片段的碱基序列。第34页,共51页，2024年2月25日，星期天序列测定方法之三DNA自动测序仪：根据Sanger法酶促原理

4种荧光染料标记引物激光照射阅读4种颜色第35页,共51页，2024年2月25日，星期天GACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAA1.部分酶切3.叠连群建立2.DNA测序CTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCA第36页,共51页，2024年2月25日，星期天克隆:是英文Clone一词的单译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆技术（Cloning）:则指由众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或细胞的技术操作。基因克隆:是指某种目的基因的分离过程，通常是将生物材料的遗传物质如DNA以酶切成片断，插入到载体中，通过无性繁殖（细菌或细胞的倍增）使其扩增，然后再以某种探针选择、钓取目的基因。§2、基因克隆（Clone）基因克隆策略：1）功能克隆：

2）定位克隆；

第37页,共51页，2024年2月25日，星期天1）功能克隆克隆（致病）基因的一种策略。收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。性状（疾病）蛋白质产物（生物学功能）从氨基酸序列出发设计DNA引物，从文库调取基因得到基因序列染色体定位疾病功能基因第38页,共51页，2024年2月25日，星期天血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症正常HbA四条多肽链（2条链，两条链）第39页,共51页，2024年2月25日，星期天

2）定位克隆又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能

疾病

基因功能第40页,共51页，2024年2月25日，星期天贺林实验室利用布依族、苗族和汉族的三个A-1型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在2q35-36区）、克隆，并首次发现了人IHH基因和该基因上的三个突变位点是导致A-1型短指（趾）症的直接原因。A-1型短指（趾）——症位点定在2q35-36区第41页,共51页，2024年2月25日，星期天1）构建基因文库：用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。cDNA文库基因克隆具体方法：第42页,共51页，2024年2月25日，星期天2）筛选文库：用放射性同位素或非放射性化学物质标记探针（待克隆的基因或cDNA的一段同源序列）同文库的细菌克隆或噬菌斑作核酸分子杂交经放射自显影或显色反应后，可以筛选出含有同探针互补序列的细菌克隆或噬菌斑然后分析这些重组载体中所插入的DNA片段或cDNA最后分离出所要的基因或cDNA。

第43页,共51页，2024年2月25日，星期天3）染色体步移知道距该基因一定距离上的一段DNA序列用该DNA序列作探针,筛查文库,得到阳性克隆分离出来重组载体中的插入片段用这个片段的末端部分作探针再一轮筛查文库得到新的重组载体中的插入片段再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因第44页,共51页，2024年2月25日，星期天4）电子杂交ESTexpressedsequencetag,EST表达序列标签，短的、