动物病毒学实验技术课件

动物病毒学试验技术杨润德动物病毒学实验技术

通过病毒学的学习，我们了解到病毒没有完整的酶系统，体内无核糖体等细胞器，因此不能在任何无生命的培养液中生长。所以要想增殖病毒必须在有生命的组织细胞内接种让其增殖，如：动物、鸡胚、细胞、器官。动物病毒学实验技术实验一、鸡胚接种

发育中的鸡胚是病毒生长良好的环境，被广泛用于病毒（特别是禽病毒）的分离培养和疫苗生产等。

病毒在鸡胚中的生长可以通过几种方法加以测定，如：采集尿囊液、羊水、绒尿膜、鸡胚作定量检定；采集以上样品作血凝滴定、血清学试验等；检查各部的病理学变化，如：鸡胚死亡、矮小、出血、羽毛发育不良、内脏坏死灶、绒尿膜水肿或增厚、坏死性痘斑、出血。动物病毒学实验技术

除鸡胚外，根据病毒特点可以选用其他禽胚，如小鹅瘟病毒宜接种鹅胚，鸭瘟宜接种鸭胚等。

影响病毒在鸡胚中生长的因素，包括鸡胚的日龄、接种途径、接种剂量、接种浓度、培养时间、培养温度。培养温度一般为35.5-37℃，有些病毒所需的温度更低。但很多哺乳动物病毒不适合在鸡胚中生长。动物病毒学实验技术1.选取SPF鸡群所产的蛋；

2.受精卵在10℃左右保存不超过10d；

3.最好选择白色卵壳的受精卵；

4.卵壳无污染，孵化前在0.1%的新洁尔灭中浸泡约15min，最后用冷水冲洗，放卵架，或将卵放卵架用甲醛（1m2用13ml甲醛、6.5gKMnO4熏蒸，而且在熏蒸时维持箱内温度为37℃20min后驱散甲醛蒸汽；

5.孵化温度保持39-40℃，相对湿度60-65%，有风扇维持空气流通，每天翻蛋3-4次。一、受精卵的质量和孵化动物病毒学实验技术

根据不同病毒的嗜性，选择适宜的接种途径。最常用的途径有卵黄囊、尿囊腔、尿囊膜3种途径，偶尔接种于羊膜腔、静脉、胚体等。在分离一种未知病毒时，最好3种途经均用，如果没有足够的受精卵，首选绒尿膜接种途径，因为大多数病毒都能适应。接种材料的处理：将组织置研钵磨碎，加5-10倍盐水并加入双抗混均，2000-3000r/min离心20-30min。取上清待用。二、接种途径动物病毒学实验技术

卵黄是胚胎的营养物质，卵黄囊膜是由内胚层发育而来的，内层覆有一层绒毛。病毒可在绒毛细胞内生长，并且可以由此扩散到胚胎的其他部位。

㈠卵黄囊动物病毒学实验技术1.取5-8日龄鸡胚，在照卵器上画出气室和胚胎的位置；

2.直立于卵座上，于气室部碘酊消毒后打孔；

3.用注射器取病料直刺入3cm回吸，如有卵黄吸出，推入毒液0.2-0.5ml，拔出针头封口。放孵化器中继续孵化，每天照卵2-3次。接种方法动物病毒学实验技术

尿囊是鸡胚的排泄器官。腔内充满排泄物尿囊液。液体的容量因卵的大小而异，一般6日龄鸡胚时约1ml，11日龄时约6ml，13日龄可高达10ml，以后逐渐减少直到消失。13日龄时的尿囊液是无色透明的，14日龄后逐渐变浑浊，呈乳白色，有时淡黄色。㈡尿囊腔接种动物病毒学实验技术1.取9-10日龄鸡胚，照卵，画出气室，离气室边缘0.3-0.5cm用铅笔作一记号；

2.在气室做记号处用碘酊消毒，打孔；

3.用注射器取毒液自接种孔斜刺入约1cm，注入毒液0.1-0.2ml；

4.封孔继续孵化，定时照蛋。接种方法动物病毒学实验技术

绒尿膜是鸡胚的呼吸器官，由尿囊膜和绒毛膜紧密粘合组成，无法分开。绒尿膜上有丰富的血管，照蛋时清晰可见。㈢绒尿膜接种动物病毒学实验技术

方法一将待检液滴在气室膜上，透过卵膜扩散到绒尿膜上。原理是气室卵膜性脆，刺破后不再闭合，而绒尿膜是活组织，有韧性刺破后能立即闭合，接种液不能透过。接种方法动物病毒学实验技术1.取9-10日龄鸡胚，照卵器画出气室范围；

2.将卵直立于卵架上，气室向上，于中央消毒打孔；

3.以1ml注射器配以2.5cm5-6号针头，自小空刺入气室约0.5cm，滴加待检液0.1-0.2ml于气室内的卵膜上，将针头继续垂直刺入，拔出针头，封口，继续孵化定时翻蛋。可随意放置。动物病毒学实验技术

方法二此法做人工气室，能保证毒液接种在绒尿膜上。

1.取9-10日龄鸡胚，画出气室及胚胎位置中的无血管区；

2.将卵横卧于卵架上，胚胎位置向上；

3.在胚胎部位及气室部碘酊消毒，气室中央打孔，胚胎部位用钢锯划破卵壳但不破坏绒尿膜；

动物病毒学实验技术4.用橡皮吸球吸气室部的空气，使卵内容物移向气室，促使破壳部位的绒尿膜下陷，形成人工气室；

5.自人工气室接种待检物0.1-0.2ml；

6.将卵壳移回原位或用灭菌玻璃纸封口用胶布固定；

7.将卵放回孵卵箱继续孵育，人工气室向上，每日检卵2-3次。动物病毒学实验技术㈠检查鸡胚接种待检材料后孵化1-6d，此期间每天最少检卵2次。接种24h死亡胚一般视为非特异性死亡，弃去。以后死亡胚立即取出放置4℃内至少4h，以使血管收缩。冷藏时间不得超过24h，否则胚液蒸发，气室卵膜难于剥离，影响病毒的收获。三、鸡胚接种后的检查和收获动物病毒学实验技术㈡鸡胚内容物的收获

1.尿囊液的收获⑴将卵直立于卵架上，气室向上；⑵气室部碘酊消毒，击破并除去卵壳；⑶用灭菌镊子撕去气室部的卵膜及绒尿膜，可见尿囊液澄清透明；⑷用吸管或注射器采集尿囊液，菌检弃去细菌污染的尿囊液。动物病毒学实验技术2、羊水的收获

⑴1-4与尿囊液的收获一样；⑵吸取尿囊液后用镊子提起羊膜，用细吸管刺入羊膜腔吸取羊水。

3、绒尿膜的收获⑴1-3与尿囊液收获相同；⑵用小剪刀剪取气室部的绒尿膜，观察病变并收获；⑶吸取尿囊液，将卵黄倒入平皿，剪断卵带收取绒尿膜低温保存。动物病毒学实验技术4.卵黄囊的收获⑴1-4与尿囊膜的收获同；⑵将卵内容物全部倒入平皿中；⑶用镊子夹住卵黄带，剪断，将卵黄囊提起，置于另一平皿内，刺破卵黄囊，用生理盐水洗去卵黄，将卵黄囊低温保存。动物病毒学实验技术实验二、细胞培养

细胞非常娇嫩，在体外培养时生长液中不能含有任何对细胞有害的物质，而且与细胞接触的玻璃器皿应不含有任何对细胞有害的物质。目前市场上有灭菌的一次性使用的96孔、24孔、12孔板及细胞培养瓶。在研究病毒时要大量增殖病毒，一次性瓶太昂贵，因此要求使用玻璃器皿，但它要经过洗涤与消毒后方可使用，并可重复使用。动物病毒学实验技术1、玻璃器皿的清洗在组织培养中工作量最大的莫过于清洗玻璃器皿。清洗的玻璃器皿要求干净透明、无油渍，而且不能含有任何毒性物质，毒性物质包括解体的微生物、细胞残余物以及非营养性的化学物质，有些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用，因此新购置的以及使用过的器皿要进行严格的清洗。一、器材的洗涤与消毒动物病毒学实验技术

⑴浸泡新购置的玻璃器皿其上带有干固的灰尘，同时生产的原因，使其常呈碱性并带有毒性物质如：铝和砷等，所以使用前用5%盐酸浸泡，以中和其中的碱便于清洗。用过的器皿往往有大量的蛋白质附着，用后立即清洗浸泡。⑵刷洗浸泡后的器皿于洗涤剂中用毛刷洗去玻璃上的杂质。动物病毒学实验技术⑶酸浸刷洗不掉的极微量的杂质，经过清洁液浸泡的强氧化作用被除掉。清洁剂对玻璃器皿无腐蚀作用。去污十分有效，是清洁过程中关键的一环。清洁液使用重鉻酸钾、浓硫酸、水按一定比例配制而成，浸泡时溶液要充满容器，不要留有空气。配制时，要将重鉻酸钾溶于水中，再缓慢加入硫酸，加硫酸时不要过急，因其产热过大，会有危险，清洁液呈棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变绿，失效。动物病毒学实验技术

强

次强

弱重鉻酸钾63g120g100g硫酸1000ml200ml100ml水200ml1000ml1000ml动物病毒学实验技术⑷冲洗酸浸后用水充分冲洗用洗涤剂彻底清洗，不留任何残迹，至少每瓶用水灌满倒掉重负12次，再用蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗3-5次晾干备用。动物病毒学实验技术2、朔料器皿的清洗先用清水浸泡冲洗，用2%NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，再用5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗3次晾干，用70-75%乙醇冲洗37℃晾干备用。

3、胶塞的清洗用水浸泡，2%NaOH煮沸10-20min，自来水冲洗，再用1%盐酸浸泡30min，流水冲洗，蒸馏水漂洗，晾干备用。动物病毒学实验技术

组织培养最重要的是防止微生物污染：其来源①组织已受污染；②操作时空气流动；③操作者的疏忽；④培养用具消毒不严。因此组织培养一定要严格消毒措施。消毒随物品的不同采用不同的方法：物理灭菌法化学灭菌法二、消毒动物病毒学实验技术1、紫外线：对空气、朔料器皿，消毒效果与距离密切相关，一般维持30min。2、干热灭菌法3、湿热灭菌法4、过滤除菌5、消毒剂，来苏、新洁尔灭、乙醇是最好的消毒剂。用来消毒桌、椅、天花板、地板，操作者的皮肤，乳酸对空气消毒十分有效。6、包装。其目的是防止再次污染。动物病毒学实验技术1、HanK’s液2、乳汉液3、0.4%酚红：酚红0.4g，0.1mol/LNaOH2.85ml，将酚红于乳钵中，加入NaOH研磨至全部溶解，加去离子水至100ml，装瓶灭菌备用。4、0.25%胰蛋白酶，用无钙镁离子的磷酸盐平衡盐水配制，并用NaHCO2将PH值调至7.8，过滤除菌分装备用。三、溶液的配制动物病毒学实验技术0.02%EDTA液，商品名为Versene，是一种螯合剂，与钙镁离子形成稳定的复合物，从而使组织细胞松散，常用于使细胞从玻面脱落。配制方法，EDTA0.2g加无钙镁磷酸盐平衡盐水1000ml，溶解后分装，高压灭菌备用。有时0.25%胰酶与0.02%EDTA等量混合，消化效果更好。5、199、1640、MEM、DMEM按说明书配制。动物病毒学实验技术6、犊牛血清，其含10多种氨基酸、激素、无机盐类及一些未知成分。不加血清的营养液，细胞不能贴壁，且生长不良。使用前56℃灭活30min，加入的量因细胞种类不同而异，5-10%。7、抗生素，①青、链霉素，配制成1万单位或1万µg/ml，使用时在营养液中加入1%。②庆大、卡那霉素，广谱抗菌素，抗霉形体且稳定，能耐高压灭菌，营养液浓度50-100µg/ml。③制霉菌素、两性霉素，配制成1000µg/ml-20℃保存，使用剂量为5-10µg/ml，视细胞耐受程度调节。动物病毒学实验技术

应用胚胎或幼小动物的组织制备培养，因其分裂旺盛，易生长。各种动物的大多数组织都能在体外培养，最常用的有肾、睾丸、肺、皮肤等。本试验以鸡胚为例：1、取10-11日龄鸡胚，气室部消毒，用无菌镊击破蛋壳，除去卵壳、卵膜；2、将鸡胚移入无菌平皿中，用无菌剪、镊去头、脚、翅、内脏、眼睛，用Hank,s也洗2次，移入三角瓶中，剪成1-2mm2小块用Hank,s洗3次。四、原代细胞培养动物病毒学实验技术3、按3-5倍加入胰酶，于37℃作用30min，每10min摇一次，静置后弃去胰酶。洗2次加入含血清的营养液或乳汉液，吹打数次。4、用2层或4层纱布过滤于离心管中，800转/分离心10分钟，取沉淀。5、按1：200-250加入营养液分装培养瓶或96孔板，于37℃静置培养。动物病毒学实验技术五、传代细胞培养由于遗传突变或在理化学物质的作用下，组织细胞中有时出现恶性变细胞，即癌变细胞。这种癌变细胞具有很高的生长和增殖势能，而且几乎可以无限传代。固称传代细胞系。其染色体已经发生改变，不再是二倍体细胞，故称异倍体细胞。有人体或动物体取得肿瘤组织进行培养，比较容易获得传代细胞系。动物病毒学实验技术

传代细胞的传代，将长满单层的细胞用消化液洗3次，消化细胞并使其从瓶壁上脱落下来，敲打细胞培养瓶，使细胞分散，加入2-3倍的营养液，分装细胞培养瓶，静置培养。待长成单层待用。动物病毒学实验技术实验三、病毒的接种及检查

不同病毒接种于细胞的时间不同①待细胞生长成单层后接种病毒；②细胞分装培养12h后接种病毒；③病毒与细胞同步接种培养。1、将病料制成1：10匀浆，加入双抗，3000转/分，离心30分钟或15000转/分离心5-10分钟，取上清待接种。2、取不同生长时期的细胞，弃去细胞培养液，按1：10接种病毒材料37℃吸附1/2-2h，使病毒吸附于细胞膜上。动物病毒学实验技术3、弃去病毒液，加入维持液，于37℃静置培养。4、逐日在显微镜下检查CPE，或进行其他试验。接种病毒2天后，如维持液混浊，说明有细菌污染，弃去。动物病毒学实验技术实验四、空斑形成技术1952年创立该试验方法，将10倍梯度稀释的病毒样本分别接种于单层细胞，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂，以防止游离病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。经过一段时间培养，进行染色感染病毒的细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落，称为空斑或蚀斑。动物病毒学实验技术

空斑是细胞病变的一种特殊表现形式。一个空斑可能有一个以上病毒颗粒感染所致，因此可将获得的单个空斑制成悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可以获得只含有一个病毒颗粒及子代的空斑，这就是病毒克隆。

动物病毒学实验技术1、测定病毒液中病毒的含量（PFU计）。2、可以用来测定某病毒的特异性抗体及抗体效价。如：新城疫病毒稀释10-6，每毫升病毒液含100个PFU，即稀释液0.1ml含10个PFU，取培养好的细胞5瓶分别接种0.1ml的病毒稀释液，其中4瓶加入不同稀释倍数的血清，根据空斑形成的多少测定出抗体的有无及抗体的效价。3、可以获得病毒的纯培养物。空斑技术的利用可以达到的目的：动物病毒学实验技术4、不同病毒形成的空斑在大小、形态（规则的圆形、欠规则的圆形、完全透明或不完全透明）、形成时间等可以有所不同，该特点有助于识别病毒，并可以此研究病毒的遗传变异。动物病毒学实验技术1、将细胞培养于扁瓶或平皿中，使其长成密集的单层，不能有空隙，吸去生长液，洗2次2、病毒用Hank,s液，做10倍连续稀释，每个稀释度接种2个培养瓶；3、37℃吸附60min，每15min转动一次；检查空斑形成的基本过程：动物病毒学实验技术4、加入融化冷却至45℃的营养琼脂覆盖单层①2×营养液﹢2%琼脂混均（8ml）加在细胞的对面，翻转，37℃培养，根据接种病毒的不同，决定加入第二层的时间（48-72h2×营养液﹢2%琼脂﹢1：1000中性红，100µg/ml混均7ml。加入的二层后继续培养，肉眼观察，空斑淡白色、背景淡红色。②2×营养液﹢2%琼脂﹢1：1000中型红，100µg/ml混均，将其加入细胞的对面翻转避光培养。逐日观察。

动物病毒学实验技术1、琼脂的质量是空斑技术的关键，要使用高级琼脂或琼脂糖；2、琼脂融化后放50℃水浴；3、只要细胞不衰老，培养时间尽量延长，使空斑充分发育；4、中性红对细胞有毒性作用，因此可用2步法或培养后用0.01%中性红染色37℃2h；5、中性红是光敏活体染料，感染细胞在可见光下培养不能产生正常空斑。观察时光线不宜过强，观察时间不宜过长，中性红现用现配。注意事项：动物病毒学实验技术动物病毒学实验技术动物病毒学实验技术动物病毒学实验技术实验五、病毒感染力的测定

感染力即毒力，可以用实验动物或鸡胚测定其半数致死量（LD50）或半数感染量（EID50）；另外可以使用组织培养细胞测定半数细胞培养感染量（TCID50）。

TCID50可用Reed-Muench法、内插法、或Karber法计算。本试验用Reed-Muench法。取长满单层细胞的96孔板，倒掉培养液，分别接种不同稀释度的病毒，每个稀释度接种8孔，每孔20µl，吸附1h后每孔加入维持液20µl，CO2条件下培养逐日观察，记录。动物病毒学实验技术病毒液稀释

细胞管数累计细胞管数细胞管总数出现CPE空%

有

CPE

无

CPE

有CPE

无CPE10-1802702710010-2801901910010-3711111291.610-43546104010-517113140.710-608021210病毒（NDV）在CPE上滴定其TCID50动物病毒学实验技术＝

高于50%的百分数-50高于50%的百分数-低于50%的百分数91.6-5091.6-40＝41.651.6＝0.8

将此值加在高于50%死亡率的稀释度的对数上。因此被测病毒的TCID50应是将病毒作10-3.8，查反对数，得6310,即是将病毒液作6310倍稀释，稀释后每20µl含有一个TCID50。由表可以看出该病毒株的TCID50在91.6%与40%之间，其确切的稀释倍数可按公式计算：动物病毒学实验技术实验六、病毒囊膜的检查

病毒的类脂主要存在于病毒的囊膜中，如果类脂溶解，囊膜即被破坏，致使病毒的感染力下降。病毒悬液用脂溶剂处理后如感染力有明显下降即证明病毒有囊膜，最常使用的脂溶剂有乙醚、氯仿、去氧胆酸钠，其中氯仿的效果最稳定。步骤：1、氯仿法：病毒液20份﹢氯仿1份混均4℃感作10min，2000转/分离心取上清待检。动物病毒学实验技术2、乙醚法：病毒液4份﹢乙醚1份混均4℃过夜，2000转/分离心取下层待检。3、去氧胆酸酸钠：用0.75%牛白蛋白配置0.2%去氧胆酸钠，保存于4℃，用前放37℃，病毒液在做实验前用5000转/分离心1h。将病毒上清与去氧胆酸钠等量混合37℃1h，放透析袋中用PB透析24h，每4h换液一次，目的是除去去氧胆酸钠对细胞的毒性作用。动物病毒学实验技术4、将取出的液体作10倍递进稀释滴定TCID50。5、每种方法均设对照。6、判定只要较对照组低2个滴度即证明敏感。动物病毒学实验技术实验七、病毒理化特性测定1、取病毒悬液2ml于试管中50℃水浴30min,2、取同样病毒液4℃30min作对照，3、2组病毒悬液分别用维持液作10倍稀释，4、用适宜的细胞测定其TCID50，较对照组低2个滴度即判为敏感。一、热灭活实验，首先提出作用温度。动物病毒学实验技术

高浓度的二价阳离子MgCl2能使某些病毒在50℃稳定，不被灭活，但对某些病毒MgCl2没有保护作用，有时甚至增加对热的敏感性。步骤：1、病毒悬液1ml﹢1mol/LMgCl29ml摇匀，2、病毒悬液1ml﹢维持液9ml摇匀，3、放50℃水浴1h后，将2组病毒液分别进行连续10稀释，测定TCID50。

二、阳离子稳定实验动物病毒学实验技术PH3或5经30min作用后，有些病毒遭受损伤而使感染力降低，但有些病毒不受影响。1、病毒液1份﹢PH3或5Hank,s9份混均，2、病毒液1份﹢PH7.2Hank,s9份混均；3、在25℃水浴中感作30min；4、用0.1mol/LNaoH将实验组PH值调至7.2；5、2组分别作连续10倍稀释测定TCID50。6、实验组较对照组低2个滴度为敏感。三、酸敏感试验动物病毒学实验技术实验八、病毒中和试验

本试验极为特异、敏感，是病毒学中重要的血清学试验。主要用于①病毒感染的血清学诊断；②病毒分离株的鉴定；③不同病毒株的抗原关系研究；④疫苗免疫原性的评价；⑤免疫血清的质量评价；⑥测定实验动物血清中是否存在抗体等。中和试验的步骤因病毒不同而变化，基本方法是病毒与血清混合，孵化后接种易感动物、鸡胚、细胞，以测定血清对病毒感染力的中和程度。动物病毒学实验技术1、稀释液：乳汉液、Hank,s液、维持液。2、病毒制剂：从感染动物分离的病毒必须在鸡胚、实验动物、细胞中连续通过几代，使其滴度稳定后，才能用于本试验。感染力不应太低。3、血清：在许多病毒感染的诊断中，常在患病急性期和康复期分别采血液，用已知病毒测定血清中和抗体的滴度。抗体滴度增高4倍以上，可认为疾病由该病毒引起。一、准备工作动物病毒学实验技术

血清使用前56℃灭活30min消除非特异性抑制物。4、病毒、血清混合液的处理：病毒与血清混合通常要37℃感作，使抗体与病毒充分混合。可根据病毒的特性采用更为适宜的处理方法。有的病毒与血清混合不经培养，立即进行试验，效果也很好；有的病毒和血清混合37℃6h再4℃过夜，此法为免疫灭活，能检出低水平的抗体。但大部分要37℃感作1h。动物病毒学实验技术5、实验系统：病毒与血清混合经培养后按病毒特征接种到易感的系统中，以检测混合液中未被中和的病毒的感染力。实验系统：⑴鸡胚：此系统中血清的中和作用测定主要根据能否阻止鸡胚死亡、绒尿膜上的豆癍形成、病毒的血凝。⑵实验动物：常用小鼠，观察死亡率、发病率。⑶细胞：大多数在聚苯乙烯微量细胞培养板上进行微量中和试验。动物病毒学实验技术

根据实验测定方法不同，中和试验可分为终点法、蚀斑减数法、交叉保护实验、动态法等4种类型。本试验以终点法中和试验为例：这是检查血清内中和抗体的最常用方法。具体方法有两种，即固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病毒法，其中以前一种方法更为常用。动物病毒学实验技术

在此实验中病毒量不变而将血清作倍比连续稀释。此法常用于测定抗血清的滴度或疫苗的免疫原性。以新城疫为例在成纤维细胞上作中和试验。1、病毒：在细胞上滴定TCID50，用稀释液稀释病毒成200TCID50/20µl。2、血清：待检血清和对照阴性血清灭活后按下表稀释。二、正式实验㈠固定病毒稀释血清中和试验动物病毒学实验技术待检血清及阴性血清的稀释

试管号12345678910稀释液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5血清量（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5稀释倍数2

481632641282565121024↘动物病毒学实验技术3、病毒-血清混合液：将病毒液0.5ml（200TCID50/20µl）与不同的待检血清和阴性血清0.5ml分别混合，在37℃水浴中作用1h。4、接种细胞培养：将