酶的生物合成

生物体内酶合成的过程称为酶的生物合成。利用微生物代谢活动生产所需酶的过程，称为酶的发酵生产。第2页,共129页，2024年2月25日，星期天微生物酶的开发应用：(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。(3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。(4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。

因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。第3页,共129页，2024年2月25日，星期天第一节酶发酵生产用微生物菌种微生物菌种是发酵生产酶的首要条件。目前投入工业发酵生产酶的菌种包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等。第4页,共129页，2024年2月25日，星期天第5页,共129页，2024年2月25日，星期天一、酶发酵生产用菌种的要求产酶量高，具有生产应用价值；易培养，即能适应大生产粗放的营养和培养条件，包括廉价原料，对工艺条件要求不苛刻；代谢速率高，发酵周期短；产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不易感染噬菌体；安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢安全无毒，在系统发育树上最好与病原体无关；选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离提取。第6页,共129页，2024年2月25日，星期天二、微生物产酶菌株的获得从土壤以及发酵生产材料中分离；菌种保存中心。第7页,共129页，2024年2月25日，星期天1、含菌样品的采集

采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。若预先不了解某种产酶微生物的具体来源，一般可从土壤分离。产纤维素产脂肪酶产果胶酶产糖化酶第8页,共129页，2024年2月25日，星期天2、菌种的分离纯化划线分离法稀释分离法第9页,共129页，2024年2月25日，星期天3.菌种的初筛第10页,共129页，2024年2月25日，星期天4.菌种的复筛5.产酶最佳条件的确定第11页,共129页，2024年2月25日，星期天6.微生物产酶性能的进一步提高经诱变获得高产菌种突变体利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量。运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境适应性更强的微生物细胞内，使其高效表达。第12页,共129页，2024年2月25日，星期天7.微生物产酶菌种的保藏斜面保藏沙土管保藏冷冻保藏第13页,共129页，2024年2月25日，星期天第二节发酵工艺条件及控制一、培养基的营养成分培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。在设计和配制培养基时，应特别注意各种组分的种类和含量，以满足细胞生长、繁殖和新陈代谢的需要，并要调节至适宜的pH。还必须注意到，有些细胞生长、繁殖阶段和发酵阶段所要求的培养基有所不同，在此情况下，要根据需要配制不同的生长培养基和发酵培养基。第14页,共129页，2024年2月25日，星期天1．碳源碳源是指能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。通常碳源同时也是提供能量的能源。碳是构成细胞成分的主要元素之一，也是各种酶的重要组成元素。所以，碳源是酶发酵生产乃至其他产物的发酵生产的必不可少的营养物质。目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如糊精、麦芽糖、葡萄糖等。第15页,共129页，2024年2月25日，星期天不同的细胞对各种碳源的利用情况大不相同，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择适宜的碳源。在酶的发酵生产中，除了要从营养的角度考虑碳源的选择以外，还要考虑到碳源对酶生物合成的调节作用，主要要考虑酶生物合成的诱导作用以及是否存在分解代谢物作用。在选择碳源时应尽量选用对所需的酶有诱导作用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，α-淀粉酶的发酵生产中，应选用对该酶有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶的生物合成有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。β-半乳糖苷酶发酵应选用乳糖为碳源，而不用或少用葡萄糖为碳源等等。在选择碳源时，必需考虑原料的供求和价格问题。第16页,共129页，2024年2月25日，星期天2．氮源氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要组成元素。凡能够向细胞提供氮源素的营养物质称为氮源。氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物。如：酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。无机氮源是含氮的各种无机化合物，如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等各种铵盐和硝酸盐等。第17页,共129页，2024年2月25日，星期天不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般说来，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮，微生物细胞中，异养型微生物用有机氮，自养型微生物用无机氮。碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影响。所谓碳氮比（C/N）一般是指培养基中碳元素（C）的总量与氮元素（N）总量之比。可通过测定或计算培养基中碳和氮的含量而求出。有的氮源及其浓度如氨基酸的变化对酶发酵有代谢调节作用。第18页,共129页，2024年2月25日，星期天3．无机盐无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的PH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。根据细胞对无机元素需要量的大小，可分为主要元素（大量元素）和微量元素两大类。主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但需要量很少，过量反而会引起不良效果，必须严加控制。

第19页,共129页，2024年2月25日，星期天各种无机元素的功用各不相同，有些是细胞的主要组分，如：磷、硫等；有些是酶的组分，如：磷、硫、锌、钙等；有些是酶的激活剂或抑制剂，如：钾、镁、铁、锌、铜、锰、钙、钼、钴、氯、溴、碘等；有些则是对pH、渗透压、氧化还原电位起调节作用的，如：钠、钾、钙、氯、磷等。其中磷是特别重要的元素，它是构成核酸和磷脂的成分。微量元素有的是某些酶的组成成分，有的是酶的激活剂，也有的是辅酶的必需成分。第20页,共129页，2024年2月25日，星期天4．生长因子生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动植物生长激素等。在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵母膏等天然原料。其中玉米浆最常用。第21页,共129页，2024年2月25日，星期天5、产酶促进剂

在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。诱导物表面活性剂

表面活性剂能够增加细胞透性，其处在气-液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性，另外还可消泡提高氧传递系数。第22页,共129页，2024年2月25日，星期天二、发酵条件的控制及对产酶的影响1、温度枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃黑曲霉的最适生长温度为28～32℃通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。第23页,共129页，2024年2月25日，星期天有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同的温度条件。在生长繁殖阶段控制在细胞生长最适温度范围内，以利于细胞生长繁殖，而在产酶阶段，则需控制在产酶的最适温度。第24页,共129页，2024年2月25日，星期天在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温度降低，两者综合，决定了培养基的温度。由于在发酵的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量差别很大，扩散和散失的热量受到环境温度等因素的影响，使培养基的温度变化明显。为此必须经常及时地进行调节控制，使培养基的温度经常维持在适宜的范围内。温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。第25页,共129页，2024年2月25日，星期天2、pH值pH影响微生物体内各种酶的活性，从而导致微生物的代谢途径发生改变。影响微生物形态和细胞膜的透性，从而影响微生物对培养基中营养成分的吸收和代谢产物的分泌。影响培养基中某些营养物质的分解或中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。第26页,共129页，2024年2月25日，星期天不同细胞生长繁殖的最适pH有所不同。一般细胞和放线菌的生长最适pH为中性或微碱性（pH6.5～8.0）；霉菌和酵母的生长最适pH为偏酸性（PH4.0～6.0）；植物细胞生长的最适pH为5～6。有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的PH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如：黑曲霉可生产α—淀粉酶，又可生产糖化酶。当培养基的PH偏向中性时，可使α—淀粉酶产量增加而糖化酶减少，反之，当培养基的PH偏向酸性时，则糖化酶产量提高而α—淀粉酶的量降低。再如用米曲霉生产蛋白酶，当培养基的PH为碱性时，主要生产碱性蛋白酶，降低培养基的PH，则主要生产中性或酸性蛋白酶。第27页,共129页，2024年2月25日，星期天

培养基的pH在细胞生长繁殖和代谢物产生的过程中往往会发生变化。这种变化与细胞特性有关，也与培养基的组分密切相关。含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使培养基的pH向酸性方向移动；含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经代谢产生较多的胺类物质，使pH向碱性方向移动；以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被细胞利用，使培养基pH下降；以尿素为氮源时，先随着尿素被脲酶水解生成氨，使培养基pH上升，然后又随着氨被细胞同化而使PH下降；磷酸盐的存在，对培养基的pH起一定的缓冲作用。所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的pH进行适当的控制和调节。PH的调节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、碱溶液，以调节控制培养基中pH变化。第28页,共129页，2024年2月25日，星期天生产上对pH的控制和调节的方法：调节培养基初始pH值，控制合适的C/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之间的比例。补料调节，即通过发酵过程中流加碳源、氮源来调节pH值添加缓冲液，维持一定的pH值如pH值变化较大，可直接加酸或碱进行调节。通过对溶解氧的调节，来控制中间代谢产物的氧化程度。第29页,共129页，2024年2月25日，星期天3、溶解氧的控制培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。调节通气量调节氧的分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质

控制溶解氧方法第30页,共129页，2024年2月25日，星期天三、固定化微生物细胞发酵产酶的工艺条件及其控制固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。1、固定化细胞的预培养固定化细胞制备好以后，一般要进行预培养，以使固定在载体上的细胞生长繁殖。待长好后，才用于发酵产酶。为了使固定化细胞生长良好，预培养应采用利于生长的生长培养基和工艺条件。然后改换成有利于产酶的发酵培养基和最佳发酵工艺条件。有时也可采用相同的培养基和工艺条件进行预培养和发酵。第31页,共129页，2024年2月25日，星期天2、溶解氧的供给固定化细胞在进行培养和发酵过程中，由于受到载体的影响，氧的溶解和传递受到一定的阻碍作用。特别是采用包埋法制备的固定化细胞，氧要通过凝胶层扩散到凝胶粒内部，才能供细胞应用，使氧的供给成为主要的限制性因素。为此，必须增加溶解氧的量，才能满足细胞生长和产酶的需要。由于固定化细胞反映器均不能采用强烈的搅拌，以免破坏固定化细胞，所以，增加溶解氧的主要方法是加大通气量。例如，游离的枯草杆菌细胞发酵生产α-淀粉酶，通气量一般控制在0.5∽1m3/(m3.min),而采用固定化细胞发酵，其通气量要1∽2m3/(m3.min),或者更多。第32页,共129页，2024年2月25日，星期天

此外，可通过改变固定化载体，固定化技术或改变培养基组分等方法，以改善供氧。例如，琼脂对氧的扩散不利，应尽量少用作固定化载体；在凝胶中加进某些物质，使其有利于氧的传递；采用过氧化氢酶与细胞共固定化，再在培养液中添加适量的过氧化氢，通过酶的作用，产生氧气，共细胞使用；降低培养基的浓度，尽量降低培养基的粘度等。溶解氧的供给，是固定化细胞好气性发酵的关键限制性因素之一。有待进一步研究解决。第33页,共129页，2024年2月25日，星期天3.温度的控制

固定化细胞对温度的适应范围较广，在分批发酵和半连续发酵中，温度不难控制。但在连续发酵过程中，由于稀释率较高，反应器内温度变化较大。若只是在反应器内调节温度，则在流加的培养液温度差别较大时，难以达到要求。一般在培养液进入反应器之前，必须预先调节到适宜温度。第34页,共129页，2024年2月25日，星期天4．培养基成分的控制培养基的浓度不宜过高，并可以通过改变培养基组分来降低培养基的黏度，有利于氧的溶解和扩散，从而克服固定化细胞好氧发酵过程中氧溶解和传递的限制。培养基的组分不能影响固定化细胞的稳定性，或影响很小。第35页,共129页，2024年2月25日，星期天四、固定化微生物原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制1、培养基渗透压的控制2、控制培养基组分、防止细胞壁再生3、维持较高的原生质体浓度第36页,共129页，2024年2月25日，星期天第三节提高酶产量的方法一、酶生物合成的调控机制Reversetranscription第37页,共129页，2024年2月25日，星期天操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。第38页,共129页，2024年2月25日，星期天根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulatorgene)、启动基因(Promotergene)、操纵基因(Operatorgene)和结构基因(Struturalgene)。第39页,共129页，2024年2月25日，星期天结构基因是编码蛋白的基因，它与多肽链有对应关系。操纵基因在操纵子中起“开关”作用，它可以与调节基因产生的别构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。启动基因有两个位点组成，一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受蛋白（CRP）的复合物（cAMP-CRP）的结合位点。只有在cAMP-CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA聚合酶才能结合到其在启动基因的位点上，这样，酶的合成才有可能开始，否则酶就无法开始合成。调节基因编码调节蛋白。第40页,共129页，2024年2月25日，星期天操纵子的类型诱导型操纵子（inducibleoperon)：在无诱导物的情况下，其基因不表达或表达的水平很低，只有当诱导物存在时，才能进行转录生成mRNA，进而经翻译合成酶。乳糖操纵子阻遏型操纵子（repressibleoperon）：在无阻遏物情况下，基因正常表达，当有阻遏物存在时，转录则受阻遏，酶不能合成。色氨酸操纵子此外，启动基因位点上的cAMP-CAP复合物的结合与否，也对酶的生物合成起调节作用。第41页,共129页，2024年2月25日，星期天基因对酶生物合成的调节控制有3种模式分解代谢物阻遏作用酶合成的诱导作用酶合成的反馈阻遏作用。第42页,共129页，2024年2月25日，星期天1、酶生物合成的诱导作用加进某种物质,使酶的生物合成开始或加速进行的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。起诱导作用的物质，称为诱导剂。第43页,共129页，2024年2月25日，星期天酶生物合成的诱导作用（A）-无诱导物时（B）-添加诱导物时第44页,共129页，2024年2月25日，星期天2、酶生物合成的反馈阻遏作用1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。第45页,共129页，2024年2月25日，星期天某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。第46页,共129页，2024年2月25日，星期天调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达色氨酸操纵子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操纵基因的调节第47页,共129页，2024年2月25日，星期天3、分解代谢阻遏某些物质（主要是葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（特别是参与分解代谢的酶）生物合成的现象称为分解代谢阻遏作用，也称为葡萄糖效应。分解代谢阻遏作用之所以产生，一是由于葡萄糖的分解代谢引起ATP浓度的上升，消耗胞内的环腺苷酸（cAMP）;二是当葡萄糖等作为唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶活性有抑制作用，降低cAMP的生成。第48页,共129页，2024年2月25日，星期天细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏)调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则cAMP的浓度降低，CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应本节目录第49页,共129页，2024年2月25日，星期天++++转录无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录有葡萄糖，cAMP浓度低时不促进转录ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正调控第50页,共129页，2024年2月25日，星期天乳糖操纵子的启动基因内，除RNA聚合酶结合位点外，还有一个称为cAMP-CAP复合物的结合位点。cAMP是环腺苷酸，CAP是降解物基因活化蛋白（又称cAMP受体蛋白，CRP）当CAP与cAMP结合后，就会被活化。cAMP-CAP复合物又会激活启动基因，使RNA聚合酶与启动基因结合。乳糖和葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物，既会阻止ATP环化形成cAMP，同时，又会促进cAMP分解AMP，从而降低cAMP的浓度，继而阻遏了乳糖降解有关的诱导酶合成。第51页,共129页，2024年2月25日，星期天二、打破酶合成调节机制限制及提高酶产量的方法1、通过条件控制提高酶产量（1）添加诱导物诱导物包括：酶的作用底物一些难以代谢的底物类似物酶催化的产物诱导物的前体物质同一种酶有多种诱导物诱导和阻遏之间没有绝对的界限，其关键在于浓度第52页,共129页，2024年2月25日，星期天（2）降低阻遏物的浓度产物阻遏作用：由酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢阻遏作用：有葡萄糖和其他容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质引起的阻遏作用。第53页,共129页，2024年2月25日，星期天为了减少或者解除分解代谢阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度。常采取的措施如下：尽量不用葡萄糖等容易被利用的碳源，而采用其他较难利用的碳源。采取补料流加以及分次流加碳源的方法，将碳源的浓度控制在较低的水平。添加一定的cAMP第54页,共129页，2024年2月25日，星期天对于受产物阻遏作用的酶（酶合成的反馈阻遏作用），可以通过以下措施降低尾产物积累，解除阻遏，从而提高酶合成的产量。在培养基中添加尾产物类似物，避免尾产物大量生成。采用尾产物的营养缺陷型菌株发酵生产酶。通过外加该营养物质，人为控制其营养物质处于亚适量状态，避免它对酶合成造成阻遏。直接去尾产物法。在培养基中添加阻止尾产物形成的抑制剂，以减少阻遏物的积累。第55页,共129页，2024年2月25日，星期天2、通过基因突变和基因重组提高酶产量通过基因工程提高酶产量的途径：使诱导型菌株变成组成型菌株使阻遏型菌株变为去阻遏型菌株（抗阻遏型菌株）。通过基因工程的手段增加细胞内的基因拷贝数。第56页,共129页，2024年2月25日，星期天诱变的方法：物理化学物理和化学的结合第57页,共129页，2024年2月25日，星期天菌株筛检（1）组成型突变株筛选将诱变后的产酶菌株在低诱导力的诱导物为主要碳源或氮源的培养基上培养，并同时限制诱导物浓度在一定水平，或同时加入诱导抑制剂，在此条件下增值的为组成型突变株。另外，将诱变后的产酶菌株在含诱导物和不含诱导物的培养基上交替培养，重复交替培养可获得突变株。第58页,共129页，2024年2月25日，星期天（2）抗分解代谢产物阻遏型突变株筛检以被阻遏物的酶的底物为唯一氮源，如产气气杆菌诱变后在含有葡萄糖和以组氨酸为唯一氮源的培养基上培养，连续转移多代，便得到产组氨酸酶的抗葡萄糖效应的变异株。变异后的产酶菌在含有葡萄糖和不含葡萄糖的培养基上交替培养。（3）抗尾产物阻遏变异株筛检可在诱变后的菌株培养基上加入结构上与尾产物类似的毒性抗代谢剂。第59页,共129页，2024年2月25日，星期天3、其他提高酶产量的方法（1）添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。第60页,共129页，2024年2月25日，星期天（2）添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。第61页,共129页，2024年2月25日，星期天第四节酶发酵动力学一、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段第62页,共129页，2024年2月25日，星期天第63页,共129页，2024年2月25日，星期天通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型：同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型第64页,共129页，2024年2月25日，星期天1、同步合成型

同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。第65页,共129页，2024年2月25日，星期天细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度活细胞浓度胞外酶浓度胞内酶浓度第66页,共129页，2024年2月25日，星期天大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶。同步合成酶生物合成调节的特点：酶的生物合成可以诱导，但是不受分解代谢物的阻遏作用和产物的反馈阻遏作用。该类型酶对应的mRNA很不稳定，其寿命一般只有几十分钟，在细胞进入生长平衡期后，新的ｍRNA不再生成,在原有的mRNA很快被降解后，酶的生物合成随即停止。第67页,共129页，2024年2月25日，星期天2、延续合成型酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如：在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶的生物合成。

第68页,共129页，2024年2月25日，星期天细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物以含有葡萄糖的果胶为诱导物第69页,共129页，2024年2月25日，星期天该类酶在细胞生长达到平衡期以后，新的mRNA不再生成，但仍可以延续合成，说明这些酶所对应的mRNA相当稳定，在平衡器以后相当长的一段时间内仍然可以通过翻译合成其所对应的酶。当延续合成型酶的生物合成可以受到分解代谢物阻遏时，在培养基中若没有阻遏物，则呈现延续合成型，而在培养基中存在阻遏物时，便成为滞后合成型。第70页,共129页，2024年2月25日，星期天3、中期合成型

中期合成型是同步合成类型中的一种特殊形式。合成特点：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。代谢调节特点：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用。第71页,共129页，2024年2月25日，星期天

枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30min左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml第72页,共129页，2024年2月25日，星期天4、滞后合成型

此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。第73页,共129页，2024年2月25日，星期天细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。第74页,共129页，2024年2月25日，星期天该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。第75页,共129页，2024年2月25日，星期天酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。第76页,共129页，2024年2月25日，星期天对于其他合成模式的酶，可通过下列措施来改变其合成模型，使其接近延续合成型：菌种选育工艺参数的优化控制发酵代谢调节第77页,共129页，2024年2月25日，星期天其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。第78页,共129页，2024年2月25日，星期天二、酶生产过程中细胞生长动力学细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程：rx=rx为细胞生长速率，X为细胞浓度，μ为生长速率假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，μ为这种限制性基质浓度的函数。μm是指限制性底物浓度过量时的比生长速率，即当S＞＞Ks时，μ=

μm；KS

为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。第79页,共129页，2024年2月25日，星期天对于游离细胞连续全混流生物培养的生长动力学方程为：

D为稀释倍数，指单位时间内刘家的培养液与发酵容器中培养液体积之比，一般以h-1，稀释D的大小在0与μm之间。第80页,共129页，2024年2月25日，星期天当稀释率小于比生长速率，即D<μ时，细胞生长速率为正值，表明发酵罐中细胞浓度不断增加，随着细胞浓度增加，限制性基质的浓度相对降低，从而使细胞生长速率μ减少，在比生长速率降低到与稀释率相等的时候，重新达到稳态。当稀释率等于比生长速率，即D=μ，细胞生长速率为0，即在一定体积的培养液中，单位时间内流出的细胞与新增值的细胞数相同，培养液中细胞浓度保持恒定不变，此时的培养达到稳态。第81页,共129页，2024年2月25日，星期天③当稀释率等于比生长速率，即D>μ，细胞生长速率为负值，在一定体积的培养液中的浓度不断被稀释而逐渐降低，随着细胞浓度降低，限制性基质的相对浓度相对升高，使比生长速率μ增大，在比生长速率升到与稀释率相同时，重新建立新的平衡，达到稳态。④而当稀释率大于最大比生长速率，及D>μm，细胞浓度趋向于0，无法建立稳态。第82页,共129页，2024年2月25日，星期天三、产酶动力学产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结构动力学。也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学或称为结构动力学。第83页,共129页，2024年2月25日，星期天宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度及细胞产酶模式有关。产酶动力学模型或产酶动力学方程可以表示为：α是与生长偶联的比产酶系数，以每克干细胞产酶的单位数表示，U/g；β为非生长偶联的产酶速率，以小时每克干细胞产酶的单位数来表示，U/（h.g)；E为酶浓度，以每升发酵液中所含的酶单位数表示，U/L；t为时间，h第84页,共129页，2024年2月25日，星期天对于同步生长型，其产酶速率与生长直接相关，其非生长偶联的比产酶速率β=0，产酶动力学方程为：生产上可通过获得高的比生长速率来提高产物合成速度。第85页,共129页，2024年2月25日，星期天中期合成期的酶，其合成模式是一种特殊的生长偶联型，当培养液中有阻遏物存在时，生长偶联的比产酶系数α=0，即无酶产生，在细胞生长，阻遏物被细胞利用完后阻遏作用解除，酶才开始合成，此阶段，产酶动力学方程与同步合成型相同。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml第86页,共129页，2024年2月25日，星期天滞后合成型为非生长偶联型，生长偶联的比产酶系数α=0，产酶动力学方程为：对于这类非生长偶联型产酶来说，应当充分注意菌体在生长期和产酶期的营养要求的差别，可适当配用快速利用和缓慢利用的营养物的比例，分别满足不同时期菌体细胞的需要。第87页,共129页，2024年2月25日，星期天延续合成型酶，在生长期和平衡期都可以产酶，其产酶动力学方程为：第88页,共129页，2024年2月25日，星期天四、固定化细胞生长和产酶动力学1、固定化细胞生长动力学

在适宜的培养基和培养条件下培养，固定在载体上的细胞能以一定的速度生长。随着细胞的生长和繁殖，有一些细胞脱落到培养液中，而成为游离细胞，它们也在培养液中生长。固定化细胞的培养系统中，包括两部分细胞：固定在载体上的细胞、游离细胞。第89页,共129页，2024年2月25日，星期天第90页,共129页，2024年2月25日，星期天细胞生长速率与细胞浓度（X）和比生长速率（μ）成正比，即：根据莫诺德方程，，固定化细胞生长动力学方程可以表示为：μmg、μmf分别代表固定在载体上的细胞和游离细胞的最大生长速率Kmg、Kmf分别代表固定在载体上的细胞和游离细胞的莫诺德常数。第91页,共129页，2024年2月25日，星期天2、固定化细胞产酶动力学固定化细胞产酶速率由固定化细胞产酶速率和游离细胞产酶速率组成，即：延续合成型固定化细胞产酶动力学方程：

αμ+β为游离细胞比产酶速率；γ为固定在载体上细胞的产酶速率第92页,共129页，2024年2月25日，星期天同步合成型固定化细胞产酶动力学方程为：中期合成型固定化细胞产酶动力学方程为：当有阻遏物时，dE/dt=0当培养基中阻遏物被消耗完后，第93页,共129页，2024年2月25日，星期天滞后合成型固定化细胞产酶动力学方程：第94页,共129页，2024年2月25日，星期天3、固定化细胞连续产酶动力学第95页,共129页，2024年2月25日，星期天第五节动植物细胞培养产酶

细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20-3001-1010-100倍增时间/h>120.3-6>15营养要求复杂简单复杂光照要求大多数要光照不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗体、酶第96页,共129页，2024年2月25日，星期天从表中可见其差异，主要有几点：动植物细胞比微生物细胞大得多。动植物细胞对剪切力敏感，其中动物细胞没有细胞壁，更为敏感。动植物细胞生长速率与代谢速率低、生长倍增时间和发酵周期均长。动物细胞营养要求比微生物细胞和植物细胞复杂，往往要求有血清或其他代用品。生产的主要产物各不相同。第97页,共129页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养有其缺点：动植物细对剪切力敏感，要求特殊生物反应器和培养方法。动植物细胞对防止杂菌污染的技术要求高；动物细胞营养要求苛刻。第98页,共129页，2024年2月25日，星期天二、动物细胞的培养产酶1、植物细胞培养的特点从天然植物中提取的方式的缺点：天然植物的产量低许多野生植物趋于濒危或灭绝引种驯化困难受自然环境和耕地的影响，栽培中产量和质量难以控制第99页,共129页，2024年2月25日，星期天植物细胞培养的优点：产率高产品质量高生产周期短可实现自动化可以进行特定的生物转化反应和探索新的合成路径，以获得新的有用物质第100页,共129页，2024年2月25日，星期天植物细胞培养的特性：细胞个大，抗剪切力低生长速度慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素细胞易聚集成团产物在细胞内且产量低细胞培养需氧，而培养液黏度大，且不能强力通风搅拌第101页,共129页，2024年2月25日，星期天产酶植物细胞酶种类胡萝卜细胞糖苷酶紫苜蓿细胞β-半乳糖苷酶假挪威槭细胞漆酶甜菜细胞、大豆细胞过氧化物酶利马豆细胞β-葡萄糖苷酶甜菜细胞酸性转化酶甜菜细胞碱性转化酶甜菜细胞糖化酶花生细胞、大豆细胞苯丙氨酸裂合酶番木瓜细胞木瓜蛋白酶大蒜细胞超氧化物歧化酶菠萝细胞菠萝蛋白酶剑麻细胞剑麻蛋白酶番木瓜细胞木瓜凝乳蛋白酶第102页,共129页，2024年2月25日，星期天第103页,共129页，2024年2月25日，星期天第104页,共129页，2024年2月25日，星期天第105页,共129页，2024年2月25日，星期天2、植物细胞培养的工艺过程细胞培养的一般工艺：材料的选择和消毒

细胞的获得

细胞培养

产物分离纯化产品第106页,共129页，2024年2月25日，星期天（1）材料的选择与消毒无病虫害，生长力旺盛，生长有规则的植株，从产生次级代谢物的组织部位中切取部分组织。取0.5-1cm的片段或小块消毒、漂洗。消毒剂：70-75%酒精、5%次氯酸钠、10%的漂白粉、0.1%升汞等。第107页,共129页，2024年2月25日，星期天（2）植物细胞的获取

①直接分离法：机械法：将外植体材料轻轻捣碎或用匀浆器破碎，然后用纱布或金属滤网过滤，并离心分离细胞。酶解法：用果胶酶、纤维素酶等处理外殖体后分离有代谢活性的细胞。（须用甘露醇等进行渗透压保护）第108页,共129页，2024年2月25日，星期天②愈伤组织诱导法愈伤组织能迅速增殖的无特定结构和功能的簿壁细胞团。可由外殖体培养1-3周而形成。过程：含一定量的生长素和分裂素的液体培养基中加入0.7—0.8的琼脂，制成半固体诱导培养基、灭菌、外植体植入、25C培养、长出愈伤组织后分散继代培养。分散细胞可用小细胞团移入液体培养液中，加玻璃珠，振荡培养，然后用适当孔径的不诱钢筛网过滤。第109页,共129页，2024年2月25日，星期天③原生质体再生法：原生质体可用植物单细胞、愈伤组织和植物的组织器官制备。常用的有纤维素酶和果胶酶的混合物。渗透压稳定剂：甘露醇、蔗糖、葡萄糖、盐类、山梨醇原生质体分离后，在一定条件下培养，再生细胞壁成单细胞悬浮液。单细胞培养细胞团细胞系第110页,共129页，2024年2月25日，星期天第111页,共129页，2024年2月25日，星期天第112页,共129页，2024年2月25日，星期天（3）植物细胞悬浮培养悬浮培养的优点：能提供大量均匀的细胞团细胞增殖的速度比愈伤组织快，适合大规模培养培养方式：分批培养法半连续培养法连续培养法（4）分离纯化第113页,共129页，2024年2月25