高效液相色谱法

高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法是20世纪70年代发展起来的一项高效快速的分离分析技术.液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术.在经典的液体柱色谱法的基础上,引入了气相色谱法的理论,在技术上采用了高压泵(一般在150-350×105Pa),高效固定相和高灵敏度(ng,pg级)的检测器,实现了分析速度快,分离效率高和操作自动化.第2页,共61页，2024年2月25日，星期天主要特点:

高压:一般在150-350×105Pa

高速:一般在1h之内完成分析高效:GC2000塔板/米;LC30000塔板/米高灵敏:

10-9gng

10-11gpg第3页,共61页，2024年2月25日，星期天

HPLC的原理及特点HPLC的主要类型及其分离原理HPLC的固定相选择

HPLC的流动相选择HPLC仪器及评价HPLC的应用第4页,共61页，2024年2月25日，星期天toMSPressuregaugeFilterPrecolumnHighpressurepumpMixingvesselInjectionportTowasteDetectorAutosamplerAnalyticalcolumnSignalcollectionPulsedamperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1VacuumpumpDegasser2第5页,共61页，2024年2月25日，星期天色谱原理ConcentrationinPhaseAConcentrationinPhaseBKD=第6页,共61页，2024年2月25日，星期天色谱原理高效液相色谱是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借助溶质在两相之间的分配系数、亲和力、吸附能力、离子交换、分子大小引起的排阻作用等差别使不同溶质进行分离（分离条件）。分离过程受溶质在两相的扩散系数、固定相填料的颗粒大小、填充密度、流动相组成及流速等因素影响。流动相固定相第7页,共61页，2024年2月25日，星期天色谱原理--分离过程ISDC第8页,共61页，2024年2月25日，星期天色谱参数--保留值保留时间

tR

保留体积VR=tRF,死时间

tM

调整保留时间t`R=tR-tM

调整保留体积V`R=t`RF

第9页,共61页，2024年2月25日，星期天色谱参数--容量因子、选择性、相对保留值容量因子k`==K=物质在固定相上的量qs物质在流动相上的量qmVsVmtR-t`RtM相对保留值a=t`R(2)t`R(1)

选择性a`==tR(2)tR(1)

1+k`(2)1+k`(1)(a`-1)=(a-1)k`(1)1+k`(1)第10页,共61页，2024年2月25日，星期天色谱参数--柱效h=h0exp{-}(t–tR)22

2理论塔板数N=()2

tR

N有效=N()2k`1+k`H有效=H()2

1+k`k`第11页,共61页，2024年2月25日，星期天色谱参数—分离度和分离效能总指标R=

2{tR(2)-tR(1)}W1+W2K1=

2{tR(2)-tR(1)}W1/2(1)+W1/2(2)R=0.59K1其它参数：谱带扩张和渗透性第12页,共61页，2024年2月25日，星期天

提高柱效—改变色谱峰的宽窄

提高选择性—改变色谱峰的间距第13页,共61页，2024年2月25日，星期天

高效液相色谱法的原理及参数

HPLC分类

HPLC仪器及评价

HPLC的应用常见问题及注意事项第14页,共61页，2024年2月25日，星期天体积排阻色谱(SizeExclusionChrom.)反相色谱(ReversedPhaseChrom.)离子交换色谱(IonExchangeChrom.)疏水作用色谱(HydrophobicInteraction)亲和色谱(AffinityChrom.)金属鏊和色谱(ChelatingChrom.)第15页,共61页，2024年2月25日，星期天SizeExclusion

Chromatography常用填料：硅胶、甘油基丙基键合、交联葡聚糖或琼脂糖、甲基丙烯酸酯等。主要公司：Merk,Pharmacia,Tosoh,Waters,Synchrom…(SEC,GFC,GPC)第16页,共61页，2024年2月25日，星期天SizeExclusionChromatography

Buffer:PBS+NaClTris-HCl+NaClGradient:No主要用于：测定分子量；目标蛋白的纯化，脱盐等.柱的选择：能够分离相对分子量的上下限为:100-800000，孔径等30KD50KD第17页,共61页，2024年2月25日，星期天IonExchangeChromproteinBProtein

BproteinBProtein

BProtein

AProteinANa+SO3+--CM常用填料：磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、表面改性硅胶等…分类：阳离子交换、阴离子交换第18页,共61页，2024年2月25日，星期天IonExchangeChromBuffer:PBS+NaClTris-HCl+NaClGradient:Yes柱的选择：当溶质在pH一定的流动相中带正电荷，

选用阳离子交换柱，否则用阴离子交换柱影响因素：盐的类型，离子强度，pH影响选择性和分离度resin-O-(CH2)2-NH+

--NCH3+CH2CH3CH2CH3resin-O-CH2-COO-resin-O-(CH2)3-SO3-第19页,共61页，2024年2月25日，星期天IonExchangeChrom第20页,共61页，2024年2月25日，星期天Affinity

Chromatography基质配基目标产物填料：基质---纤维素、凝集素、交联琼脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃…配基---抗体、凝集素、酶、抑制剂、抗生素、配位体…第21页,共61页，2024年2月25日，星期天AffinityChromatographyUVabsorbanceFreeligandconcentration柱的选择：根据被分离目标产物的特点选择合适的色谱柱，重要是配基。影响因素：配基容易被杂质污染，柱子的寿命短，样品须前处理。主要用于纯化较为昂贵的蛋白，抗体等。Buffer:含有可以与基质上的配基结合物的溶液Gradient:Yes第22页,共61页，2024年2月25日，星期天HydrophobicinteractionChromatography

proteinsurface---+++-nonpolarnonpolar填料：基质：有机聚合物（交联琼脂糖、乙烯聚合物、TSK-PW）和大孔硅胶键合相配基：苯基、戊基、丁基、羟丙基、乙基、聚乙二醇、苄基等H3C-C-N-C-O-H3C-C-N-C-O-NHOH3C-C-N-C-O-NHOONH第23页,共61页，2024年2月25日，星期天decreasingsaltconcentrationUVabsorbanceHydrophobicInteractionChromatography柱的选择：根据被分离目标产物的疏水性选择合适的色谱柱，基质和配基的类型是关键。影响因素：盐的种类，离子强度，溶液的pH以及温度对疏水作用都影响较大。Buffer:

常用：(NH4)2SO4,PBS,pH4~8Gradient:Yes第24页,共61页，2024年2月25日，星期天ReversedPhaseChromatography反相色谱是指流动相的极性大于固定相的分离体系，其分离机理主要基于溶质与固定相疏水作用的差别填料：基质：硅胶配基：

C18,C8,C4,Phenyl硅胶硅胶第25页,共61页，2024年2月25日，星期天ReversedPhaseChromatography柱的选择：根据被分离目标产物的疏水性及分子大小选择合适的色谱柱。C18稳定性高，有效孔径小，对分离蛋白容易产生不可逆吸附。影响因素：流动相的组成，溶液的pH以及温度。第26页,共61页，2024年2月25日，星期天ComparisonbetweenRPCandHIC

RPCHIC分离机理强疏水性弱疏水性配基C18,C8,C4,Phenyl

复杂流动相有机相，水相，梯度蛋白的分离容易失活失活<10%

常用于分析可用于制备可分离物

范围较大相对较小操作方式

高压常压第27页,共61页，2024年2月25日，星期天ComparisonbetweenRPCandNPC正相色谱-流动相的极性小于固定相的分离体系；机理-被分离化合物的极性基团与固定相的极性基团相互作用；流动相-非极性的有机溶剂加入极性的有机溶剂；分离-异构体，易水解，在极性溶剂中溶解度小的物质。反相色谱-流动相的极性小于固定相的分离体系；机理-被分离物的与固定相的疏水相互作用力的差别；流动相-极性的有机溶剂或水；分离-范围最广。RPCNPC第28页,共61页，2024年2月25日，星期天液相色谱固定相1、液液色谱法及离子色谱法固定相全多孔型担体表面多孔型担体

化学键合固定相

Si-O-CSi-O-Si-CSi-CSi-N

Si-O-Si-C化学键稳定，耐水、耐热、耐有机溶剂，第29页,共61页，2024年2月25日，星期天化学键合固定相具有的特点：1）表面没有液坑，比一般液体固定相传质快。2）无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命。3）可以键合不同官能团，能灵活的改变选择性4）有利于梯度洗涤，有利于配用灵敏检测器和馏分的收集第30页,共61页，2024年2月25日，星期天2液固吸附色谱法固定相

硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等3离子交换色谱法固定相

薄膜型离子交换树脂

离子交换键合固定相

阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性树脂）

阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性树脂）第31页,共61页，2024年2月25日，星期天4空间排阻色谱固定相

软质凝胶葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶水为流动相

半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚凝胶(交联聚苯乙烯凝胶)适用于非极性有机溶剂,丙酮乙醇等极性溶剂不能用.

硬质凝胶

多孔硅胶多孔玻璃珠等第32页,共61页，2024年2月25日，星期天液相色谱流动相

GCN2H2HeLC流动相的种类,流动相的配比能显著影响分离效果.流动相选择:

1)流动相纯度AR2)应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂

3)对样品要有适宜的溶解度

4)溶剂的黏度小一些为好

5)应与检测器相匹配第33页,共61页，2024年2月25日，星期天常用溶剂的极性顺序:

水(极性最大),甲酰胺,乙腈,甲醇,乙醇,丙醇,丙酮,四氢呋喃,甲乙酮,正丁醇,乙酸乙酯,乙醚,二氯甲烷,氯仿,溴乙烷,苯,甲苯,四氯化碳,二硫化碳,环己烷,己烷,庚烷,煤油,石油醚(极性最小).第34页,共61页，2024年2月25日，星期天

为了获得合适的溶剂强度(极性),常采用二元或多元组合的溶剂体系作为流动相.采用的溶剂可分为底剂及洗脱剂两部分底剂决定基本的色谱分离,洗脱剂具有对组分选择性分离

正相色谱中底剂采用低极性溶剂,洗脱剂选择极性较强的溶剂.

反相色谱中底剂采用强极性溶剂(水),洗脱剂选择极性较弱的溶剂(有机溶剂).第35页,共61页，2024年2月25日，星期天

离子交换色谱主要在含水介质中进行,组分保留值可以用流动相中盐的浓度和pH来控制,增加盐的浓度导致保留值降低,由于流动相离子与交换树脂相互作用力不同,因此流动相中离子类型对样品组分的保留值有显著影响.一般阴离子的滞留次序为:

柠檬酸离子＞SO4

＞草酸离子＞I＞NO3

＞CrO4

＞Br＞SCN＞Cl＞HCOO＞CH3COO＞OH＞F一般阳离子的滞留次序为:Ba

＞Pb＞Ca＞Ni＞Cd＞Cu＞Co＞Zn＞Mg＞Rb＞K＞NH4＞Na＞H＞Li第36页,共61页，2024年2月25日，星期天

排阻色谱法所用的溶剂必须与凝胶本身相似,才能润湿凝胶并防止吸附.

一般情况下,

对分离高分子有机化合物采用溶剂主要是四氢呋喃,甲苯,间甲苯,苯酚,NN-二甲基甲酰胺等.

生物物质的分离主要用水,缓冲盐溶液,乙醇及丙酮等.第37页,共61页，2024年2月25日，星期天HPLC分离类型的选择

应用HPLC对样品进行分离分析应考虑各种因素,包括样品的性质(相对分子量,化学结构,极性,溶解度参数等化学性质和物理性质),液相色谱分离的类型的特点及应用范围,实验室条件(仪器,色谱柱,检测器等)等因素.

相对分子量较低,挥发性较高的试样适用于GC分析.

标准的LC类型(液-固,液-液,离子交换,离子对色谱,离子色谱等)适用于分离相对分子量为200到2000的试样,而大于2000的则用空间排阻色谱.

第38页,共61页，2024年2月25日，星期天试样相对分子量相对分子量大于2000小于2000不溶于水溶于水排阻色谱,水为流动相排阻色谱,非水流动相不溶于水同系物—正相或反相色谱异构体多官能团—吸附色谱分子量大小差异—排阻色谱溶于水,不离解反相色谱排阻色谱,水为流动相溶于水,可离解碱-----阳离交换色谱酸-----阴离交换色谱溶于水,离子和非离子反相离子对色谱

第39页,共61页，2024年2月25日，星期天toMSPressuregaugeFilterPrecolumnHighpressurepumpMixingvesselInjectionportTowasteDetectorAutosamplerAnalyticalcolumnSignalcollectionPulsedamperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1VacuumpumpDegasser2第40页,共61页，2024年2月25日，星期天第41页,共61页，2024年2月25日，星期天DegasserMembraneVacuumchamberPressuresensorControllerThree-wayvalveVacuumpumpHPLCpumpEluent高效液相色谱仪单元介绍第42页,共61页，2024年2月25日，星期天PumpPPtt第43页,共61页，2024年2月25日，星期天PumptowastePurgevalveABCDtomixingchamberAB四元梯度泵--低压混合二元梯度泵--高压混合比例伐第44页,共61页，2024年2月25日，星期天Damper第45页,共61页，2024年2月25日，星期天Autosampler第46页,共61页，2024年2月25日，星期天Injectionport第47页,共61页，2024年2月25日，星期天DetectorConductivityDetector

UV/VisDetectorFixedWavelengthDetector

variablewavelengthdetectorPhotoDiodeArrayDetector

RefractiveIndexDetector

FluorescenceDetector

ElectrochemicalDetectorMassSpectrometryEvaporativeLightScatteringDetector

第48页,共61页，2024年2月25日，星期天UV/Vis--FixedWavelengthDetector第49页,共61页，2024年2月25日，星期天UV/Vis--variablewavelengthdetectorTheUV/Vissourceusuallycomesfromamonochromatorsothewavelengthcanbeselected,orscanned.Absorbanceincreasesaseluatepassesthroughthecell.Ifwavelengthscanningisdesired,theflowisstoppedlongenoughforthescantotakeplace.第50页,共61页，2024年2月25日，星期天UV/Vis--PhotoDiodeArrayDetector第51页,共61页，2024年2月25日，星期天ConductivityDetectorSensitivitiesforcompoundssuchasphenol,catecholamines,nitrosamines,andorganicacidsareinthepicomole(nanogram)Themobilephasemustbemadeelectricallyconductive,usuallybytheadditionofasuitablesalt第52页,共61页，2024年2月25日，星期天RefractiveIndexDetectorAvalveisopenedandpuresolventpassesintoonehalfofacell.Theeluateflowsthroughtheotherhalfofthecell.Thetwohalvesareseparatedbyaglassplatemountedatananglesuchthatbendingoftheincidentbeamoccursifthetwosolutionsdifferinrefractiveindex.第53页,共61页，2024年2月25日，星期天FluorescenceDetector

Shortpass-transmitsallwavelengthsbelowaspecifiedcutoffLongpass-transmitsallwavelengthsaboveaspecifiedcutoffBandpass-blocksallwavelengthsoutsideaspecifiedband第54页,共61页，2024年2月25日，星期天ElectrochemicalDetectorDetectorsthatbasedonelectroanalyticalproceduresareavailable.Theyoffertheadvantagesofhighsensitivityandsimplicity第55页,共61页，2024年2月25日，星期天EvaporativeLightScatteringDetectorThescatteredlightisdetectedbyasiliconephotodiodelocatedat90oanglefromthelaser,thephotodiodeproducesasignalwhichissenttotheanalogoutputsforcollection,alighttrapislocated180ofromthelasertocollectanylightnotscatteredbyparticlesintheaerosolstream第56页,共61页，2024年2月25日，星期天OtherDetectorProgrammableDetectorsChemiluminescencedetectionRadioactivitydetectionPulsed-amperometricdetectionFT-IR第57页,共61页，2024年2月25日，星期天ComparisonbetweendifferentdetectorsDetectorCompoundsSensitivityUVUV/Vischromophoressuchasaromatics,aldehydes,ketones1ppbRIUniversal,allcompounds-cannotusegradientmobilephases10ppm