仪器分析学生实验NBS荧光素CTAC化学发光体系测定尿素的含量省公开课一等奖全国示范课微课金奖

《仪器分析》学生试验课件

NBS-荧光素-CTAC化学发光体系

测定尿素含量化学化工学院环境科学教研室方卢秋年秋期1/27目录一、概述二．试验目标意义和要求三、试验原理1.试验装置示意图2.化学发光原理四、仪器药品1．主要仪器2．主要药品及贮备液配制五、试验内容及操作步骤1.试验主要内容2.试验操作步骤六、数据处理七、思索题2/27一、概述1.化学发光及化学发光分析化学发光（Chemiluminescence）又称为冷光（ColdLight），是在没有任何光、热或电场等激发情况下，由化学反应而产生光辐射。生命系统中化学发光，称为生物发光（Bioluminescence），它不依赖于有机体对光吸收，而是一个特殊类型化学发光。化学发光分析（ChemiluminescenceAnalysis）就是利用化学反应所产生发光现象进行分析方法。是近30多年来发展起来一个新型、高灵敏度痕量分析方法。在痕量分析、环境科学、生命科学及临床医学、食品安全等领域得到愈来愈广泛应用。3/27生物化学发光图4/272.化学发光分析基本原理化学发光是吸收化学反应过程产生化学能，使反应产物分子或者其它物质分子被激发而发射光辐射。任何一个化学发光反应都应包含化学激发和发光两个步骤，必须满足以下条件：（1）化学反应必须提供足够激发能，激发能主要起源于反应焓。（2）要有有利化学反应历程，使化学反应能量最少能被一个物质所接收并生成激发态。（3）激发态能释放光子或能够转移它能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子形式回到基态。化学发光反应效率

cl，又称化学发光总量子产率，决定于生成激发态产物分子化学激发效率

ce和激发态分子发射效率

em。定义为：

cl=发射光子分子数/参加反应分子数=

ce

em5/273.化学发光反应类型3.1直接化学发光和间接化学发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。A+B

C*+DC*

C+h

式中A或B是被测物，经过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射光子。6/27间接发光是被测物A或B，经过化学反应生成初始激发态产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。A+B

C*+DC*+F

F*+EF*

F+h

式中C*为能量给予体，而F为能量接收体3.2气相化学发光、液相和固相化学发光按反应体系状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不一样相中进行则称为异相化学发光。（1）气相化学发光主要有O3、NO、S化学发光反应，可用于监测空气中O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。（2）液相化学发光用于这类化学发光分析发光物质有鲁米诺、光泽精等。7/273.3化学发光、生物化学发光和电致化学发光分析法依据供能反应特点，可将化学发光分析法分为：1）普通化学发光分析法(供能反应为普通化学反应；简称CL)；2）生物化学发光分析法(供能反应为生物化学反应；简称BCL)；3）电致化学发光分析法(供能反应为电化学反应，简称ECL)等。8/273.4直接测定、偶合反应、时间分辩和酶免疫化学发光分析法依据测定方法不一样又可分为：1)直接测定

CL分析法；2)偶合反应CL分析法(经过反应偶合，测定体系中某一组份)；3)时间分辨CL分析法(即利用多组份对同一化学发光反应影响时间差实现多组份测定)；4)酶免疫CL分析法等。9/274.化学发光测量装置化学发光分析法测量仪器主要包含样品室、光检测器、放大器和信号输出装置。化学发光反应在样品室中进行，样品和试剂混合方式有不连续取样体系，加样是间歇。将试剂先加到光电倍增管前面反应池内，然后用进样器加入分析物。另一个方法是连续流动体系，反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应，且在载流推进下向前移动，被检测光信号只是整个发光动力学曲线一部分，以峰高进行定量测量。按照进样方式，可将化学发光分析仪分为分离取样式和流动注射式两类。10/27BPCL型微弱发光测量仪

11/27IFFM-D型流动注射化学发光分析仪12/275.流动注射分析介绍流动注射分析是70年代中期诞生并快速发展起来溶液自动在线处理及测定当代分析技术。流动注射分析方法主要有：流动注射分光光度法、流动注射原子光谱法、流动注射电化学分析法、流动注射酶分析法、流动注射荧光及化学发光法、流动注射免疫分析法、流动注射在线分离浓集、在线消解等操作方法和技术。13/27流动注射法含有以下优点①测量在动态条件下进行，反应条件和分析操作能自动保持一致，结果重现性好;②耗样量少、分析速度快，尤其适合于大批量样品分析；③不但易于实现连续自动分析，且可方便地用于比色、离子电极、原子吸收分析。14/276.流动注射化学发光分析仪介绍IFFM-E型流动注射化学发光分析仪是国内最早推出全自动化学发光检测分析系统。仪器集成了高精度双蠕动泵数控宽调速流动注射进样系统，多功效超微弱化学发光检测器及功效强大化学发光检测与数据采集及化学分析动力学谱图分析软件。可进行静态注射化学发光分析、流动注射化学发光等分析。15/277.尿素及其分析方法尿素，又称为脲，其作用与山梨醇基本相同，为渗透性利尿药。临床用于脑水肿、颅内压增高、青光眼，烧伤、创伤和术后尿少症，外用可治疗一些皮肤病。尿液和血清尿素氮测定，对急性肾功效衰竭，尤其是尿毒症诊疗有特殊价值，其增高程度与病情严重性成正比，对判断病情和预后估价有主要作用。建立快速、准确、灵敏尿素测定方法，在药品分析、临床治疗、医学诊疗等方面有主要意义。测定尿素方法主要有：生物传感器法，紫外/可见法，HPLC法等。16/27在碱性条件下，荧光素作为能量转移剂，NBS氧化尿素产生化学发光，十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）对该体系含有强烈增敏作用，据此建立NBS-荧光素-CTAC流动注射化学发光体系测定尿素分析方法。含有更宽线性范围和更低检出限。测定线性范围为：3×10-5～7×10-8g/mL，方法相对标准偏差（RSD）为4.6%(5×10-8g/mL，n=11）,检出限（3σ）为3.0×10-9g/mL。本法可用于人体尿液中尿素含量测定。17/27二．试验目标意义和要求1.巩固化学发光分析法理论知识。2.了解流动注射化学发光分析仪结构，掌握仪器操作、化学发光试验原理。3.掌握化学发光试验条件优化操作步骤，建立流动注射化学发光分析法。18/27三、试验原理1.试验装置示意图P1,P2.蠕动泵；V.八通阀；F.流通池；PMT.光电倍增管；HV.负高压；PC.计算机控制化学发光分析仪。A.样品，B.NBS，C.荧光素＋NaOH＋CTAC溶液。19/272.化学发光原理碱性条件下，NBS氧化性来自其水解产物HBrO，其氧化特征类似于HBrO，但较HBrO稳定。尿素分子中含有还原性胺基（-NH2），可被HBrO氧化，产生化学能激发共存荧光素，从而产生化学发光。可能反应机理以下：NBS＋H2O→NHS＋HBrO即尿素＋HBrO＋OH-→产物*产物*＋荧光素→荧光素*＋产物荧光素*→荧光素＋hν20/27四、仪器药品1．主要仪器IFFM－D型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈电子科技有限企业生产）；离心机（0－4000r/min，常州国华电器有限企业生产）；电子分析天平（EL104，梅特勒-托利多（上海）有限企业）。2．主要药品及贮备液配制21/27五、试验内容及操作步骤1.试验主要内容1.1样品稀释酸碱性选择试验盐酸、硫酸、氢氧化钠、碳酸氢钠，水稀释作对照，浓度为0.05mol/L。1.2荧光物质种类选择试验罗丹明-6G、荧光素钠、荧光素、二氯荧光素，水稀释作对照，浓度为8×10-5mol/L。1.3荧光物质浓度选择试验荧光素浓度在1×10-6～8×10-4mol/L范围内选择。1.4反应介质种类选择试验氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠，水稀释作对照，浓度为0.05mol/L。22/271.5反应介质浓度选择试验考查荧光素中氢氧化钠在0.03-0.50mol/L浓度范围内对化学发光信号强度影响。1.6表面活性剂种类选择试验十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、吐温80、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC），水稀释作对照，浓度为3×10-3mol/L。1.7表面活性剂浓度选择试验考查CTAC物质量浓度在5×10-4～7×10-3mol/L范围内对化学发光信号强度影响。1.8NBS浓度选择试验试验考查NBS物质量浓度在0.008～0.03mol/L浓度范围内对化学发光体系影响。23/272.试验操作步骤2.1化学发光仪使用A．连接好蠕动泵、化学发光仪主机、分离式检测器、计算机主机及打印机电源线、信号线和聚四氟乙烯管路系统，仔细检验管线连接无误。B．打开总电源开关，开启化学发光仪主机电源、打印机电源、蠕动泵电源，再按下计算机电源开启电脑，点击IFFM分析系统，开启分析应用软化程序，进入主界面。C．编辑或者打开参数文件。D．所配制各种溶液插入聚四氟乙烯管。E．点击开启测量按钮，仪器开始测量过程，依据需要调整测量时间、主副泵转速，依据信号大小调整负高压及增益。F．测量完成，用蒸馏水洗涤各流路，洗涤时间不少于5分钟，抽干5分钟，松开蠕动泵。G．保留用户文件，关闭应用程序。运行计算机系统退出程序，关闭各仪器电源，最终关闭总电源开关。24/272.2样品处理取健康人体新鲜尿液50mL，用移液管移取10.0mL，以3500