《DB32T 3762.14-2021新型冠状病毒检测技术规范 第14部分N亚基因组荧光PCR检测程序》

ICS11.020

C62DB32

江苏省地方标准

DB32/T3762.14—2021

新型冠状病毒检测技术规范

第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part14:Real-timefluorescencePCRtestNsubgenomicRNAprocedure

2021-12-09发布2022-01-09实施

江苏省市场监督管理局发布

DB32/T3762.14—2021

I

DB32/T3762.14—2021

新型冠状病毒检测技术规范第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序

1范围

本文件规定了新型冠状病毒N亚基因组荧光PCR检测环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、样

本前处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增、结果判定。

本文件适用于新型冠状病毒N亚基因组荧光PCR检测，为判断样本中的新型冠状病毒是否具有感

染性提供辅助手段。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本

文件。

DB32/T3762.3新型冠状病毒检测技术规范第3部分：核酸荧光PCR检测程序

3术语和定义

3.1

亚基因组RNAsubgenomicRNA，SgRNA

在结构上由病毒5’UTR区Leader序列及各基因转录RNA片段构成，亚基因组的出现可反应病毒复制

状态，从而代表病毒的感染性。

4环境与设施

同DB32/T3762.3的4.1条和4.2条。

5设备与耗材

同DB32/T3762.3的5.1条和5.2条。

6试剂与材料

6.1试剂

6.1.1病毒核酸提取试剂盒。

6.1.2实时荧光PCR检测试剂。

6.2引物与探针

1

DB32/T3762.14—2021

新型冠状病毒N亚基因组的荧光定量PCR引物、探针组合物（序列见附录A），其中探针的5’端

标记的是FAM荧光报告基团，3’端标记的是BHQ1荧光淬灭基团。阴性对照为DEPC水、阳性对照为含N

亚基因组片段的质粒（序列见附录A）。

6.3材料

同DB32/T3762.3的6.2条。

7样本前处理与核酸提取

同DB32/T3762.3-2020的7.1条和7.2条。

8扩增体系配制与扩增

8.1采用实时荧光PCR检测试剂，根据试剂说明书配制荧光PCR扩增体系，N亚基因组反应体系中

上/下游引物（20μmol/L）0.4μL/0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL每个反应体系中加入模板RNA4μL

(或阳性、阴性对照)、无RNAase灭菌水加至20μL。

8.2按以下参数进行荧光PCR扩增（具体扩增条件可根据实时荧光PCR检测试剂进行调整），42℃

5min，95℃10sec，45个循环的95℃5sec，55℃34sec，在每个55℃反应结束时收集荧光信号。

9结果判定

9.1阈值设定

阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。

9.2质控标准

9.2.1一般要求

检测结果中的阴、阳性对照均符合以下情况，如对照不成立，此次试验视为无效。

9.2.2阴性对照

阴性对照无扩增曲线，或Ct值大于40。

9.2.3阳性对照

阳性对照出现典型的扩增曲线呈S型，且Ct值小于或等于35。

9.3结果判断

9.3.1阳性判定：检测样本N亚基因组的Ct值小于或等于40，并有明显扩增曲线，则判定为亚基因

阳性。

9.3.2阴性判定：在对照成立下，如果检测样本N亚基因组没有出现扩增曲线，或Ct值大于40，则

判定为亚基因阴性。

9.3.3不确定结果：在对照成立下，如果检测样本N亚基因组扩增曲线不典型，结果不确定，建议重

复检测。

2

DB32/T3762.14—2021

AA

附录A

（规范性附录）

新型冠状病毒N亚基因组实时荧光PCR引物与探针序列及阳性对照片段序列

A.1表A.1中给出了新型冠状病毒N亚基因组实时荧光PCR检测的引物与探针及阳性对照片段序列。

表A.1新型冠状病毒N亚基因组实时荧光PCR引物与探针序列及阳性对照片段序列

引物名称引物序列(5'to3')长度（bp）

nCov-SgRNAN-FACCAACTTTCGATCTCTTGTAGA23

nCov-SgRNAN-RTGAGGGTCCACCAAACGTA19

nCov-SgRNAN-ProbeCAGCGAAATGCACCCCGCA19

ACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTT

阳性对照新型冠状病毒N亚CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTATGTCTGATA

115

基因片段ATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCC