生物工程实习报告

Novoprotein专业实践报告报告人：学号：2014.1.18

熟悉、了解、掌握质粒EGFP和LGALS1分别作为模板，设计引物扩增EGFP基因和LGALS1基因，通过Novorec的方法将两个片段同时重组到pET21a载体上的相关理论知识。绿色荧光蛋白-人LGALS1融合蛋白大肠杆菌的表达载体的构建及纯化理论学习抽提质粒作为模板，扩增EGFP基因和LGALS1基因，重组到pET21a载体上，表达筛选，蛋白检测，蛋白纯化。实验操作A接菌抽提、PCR反应、电泳检测

BC重组、转化、阳性鉴定D酶切过夜、电泳检测、产物回收

质粒抽提、电泳检测

SDS电泳检测EWesternBlot免疫印迹

FG带His标签的人重组蛋白的纯化

一、接菌抽提、PCR反应、电泳检测

Kit抽提↓

PCR反应

↓电泳上样检测

质粒抽提检测PCR反应检测

二、

酶切过夜、电泳检测、产物回收PCR反应产物酶切↓37℃恒温水浴锅过夜↓配胶↓电泳检测↓割胶回收酶切产物电泳检测三、

重组、转化、阳性鉴定目的基因、载体重组↓转化↓挑菌、37℃培养↓PCR阳性鉴定↓电泳检测四、质粒抽提、电泳检测碱法抽提质粒→电泳检测

六、WesternBlot免疫印迹标签C-His抗体C-His抗体-HRPLaneA:PrestainedMolecularweightmarkerLaneB:I-1-1LaneC:I-1-2LaneD:I-1-3LaneE:诱前LaneF:阳LaneG:81LaneH:82LaneI:83ABCDEFGHI结论：综合SDS,此株菌均有表达。

七、RFPPurification

batch20140117Proteinexpression(2014-01-12)ABMKMedium:XY1,4L,OD600:2.0,add0.1mMIPTG,incubateat16℃overnight.EndOD600:7.1Cellweight:48.4gBatch:RFP-4L-20140112菌种编号：RFP-1-20140110TargetproteinwasexpressesobviouslyLaneA:non-inducedcrudeLaneB:inducedcrudeMK:Molecularweightmarker60KD120KD20KD90KD40KD30KD14KDLysisbyultrasonication(2014-01-17)Lysisbuffer:20mMTris,250mMNaCl，10mMimidazolepH8.0(40ml)Cell:2g(:RFP-4L-20140112)

ABC

MKLaneA:FulllysateLaneB:PrecipitationoflysateLaneC:SupernatantoflysateMK:MolecularweightmarkerInclusionbodyproteinwasexpressedobviously60KD120KD40KD20KD14KD30KD90KDPurificationbyChelatingSFF(Ni)column（2014-01-17）Sample:Supernatantoflysate(2014-01-17)BufferA:20mMTris,250mMNaCl,10mMImidazole,pH8.0BufferB:20mMTris,250mMNaCl,500mMImidazole,pH8.0Column:ChelatingSFF(Ni)column(CV20ml)LaneA:Loadsample(23ml)LaneB:Flowthrough(28ml)LaneC:Elutionby50mMImidazole(5ml)LaneD:Elutionby100mMImidazole(6ml)LaneE:Elutionby250mMImidazole(4ml)LaneF:Elutionby500mMImidazole(2ml)MK:MolecularweightmarkerMK