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一种判定中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮相关性的方法专利名称:一种判定中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮相关性的方法技术领域:本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种判定中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮相关性的方法。背景技术:白介素-12(IL-12)是一种异源二聚体细胞因子,主要在固有免疫应答的过程中由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞以及B淋巴细胞产生。一般认为,IL-12是固有免疫对病原体的识别与产生适应性免疫应答的重要连接桥梁,是一种免疫调节因子。IL-12b,也称p40,是IL-12的其中一个成分,能与p35(IL_12a)以共价键结合而形成成熟的IL-12蛋白。此外,IL-12b还能与pl9(IL_23a)相互作用形成IL-12家族的另一成员——IL-23。IL-23对T淋巴细胞的一个新的亚型——辅助性T淋巴细胞17(Thl7)具有很强的趋化作用。Thl7细胞能特征性产生细胞因子IL-17,后者与许多自身免疫性疾病的病理生理有明显的相关。鉴于IL-12和IL-23在自身免疫性疾病的重要作用,其两者的共同成分,IL-12b可能是自身免疫性疾病的一个重要的候选基因。目前已经发现,IL-12b与银屑病、类风湿性关节炎以及I型糖尿病等自身免疫性疾病相关。系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及多器官的复杂自身免疫病,自身抗体的产生、免疫复合物的形成以及组织炎症是其主要的临床特征。文献报道SLE的发病率为20-150人/10万人,男女比例为1:9。SLE的病因尚未完全清楚,一般认为基因与环境因素对其发病均有影响。近期,有系列的全基因组关联研究(GWAS)探讨SLE与基因多态性关系,使人们对这一复杂疾病有了更深入的了解。发明内容本发明的目的在于根据现有的对SLE研究中存在的不足,提供一种方法,可以用于判定中国汉族人IL_12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的相关性。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种判定中国汉族人IL_12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮相关性的方法,该方法是非标记探针的高分辨率溶解曲线法。更进一步地,上述方法包括如下步骤(1)基因分型取外周血基因组DNA,采用非标记探针的高分辨率溶解曲线法鉴定其基因型;(2)统计学分析采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率在病例组与正常组之间的差异来分析SNP是否与疾病相关,以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析,用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度,P值小于O.05认为是有统计学意义。作为一种优选方案,所述非标记探针的高分辨率溶解曲线法是首先进行不对称PCR,20mL体系含基因组DNA模板20ng,fPCR缓存液,200mMdNTPs,0.5UrTaqDNA聚合酶,O.05mM正向引物,O.5mM反向引物和O.5mMC3封闭的探针。PCR反应在Bio-RadS1000PCR仪上进行;PCR扩增条件如下94°C预变性2分钟,继之进行50个循环,包括94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸20s,最后72°C延伸5min;反应结束后转移10mLPCR产物到HR-1专用的毛细管中,再加入ImLLCGreenPlus染料后,最后以HRMinCFX96实时荧光系统C1000ThermalCycler进行检测;样本先95°C变性30s,再迅速冷却到40°C30s,然后以O.3°C/s速率从55°C升温至90°C熔化,熔化曲线用Bio-RadPrecision分析软件进行分析;所述rs6887695引物序列为正向SEQIDN0:1,反向SEQIDN0:2;非标记C3阻断探针序列SEQIDNO:3。与现有技术相比,本发明具有如下有益效果HRMA结合非标记探针成功地区分所有的基因型。SLE患者的基因型和rs6887695等位基因频率与健康对照组的差异有统计学意义。rs6887695次等位基因(C)对SLE具有保护作用(P=O.031,ORO.78,[95%ClO.63-0.98])对rs6887695基因的单核苷酸多态性与SLE诊断指标相关性的研究发现,rs6887695次等位基因(C)对关节症状的发生率(P=O.013,OR=O.65,95%CI=O.47-0.92)以及抗核抗体异常(P=O.022,OR=O.68,95%CI=O.49-0.95)具有保护作用。IL_12b单核苷酸多态性与SLE其它诊断指标无相关性。因此,在中国汉族SLE患者中,IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与SLE的发病危险度相关,也与关节炎和自身抗体的产生相关。图1为非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型;图中显示探针区和非探针区rs6887695的熔融曲线图。图2为标准化后的溶解曲线和差异曲线显示样本的基因型;(A)标准化后的溶解曲线图;(B)差异曲线图。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1研究人群研究在北京大学深圳医院共招募了297名符合美国风湿病学会有关SLE诊断标准的SLE患者(男27人,女270人,中位年龄29岁,年龄跨度为12-55岁,)和351名健康对照人群(男31人,女320人,中位年龄为28岁,年龄跨度为17-46岁)。所有对照组人员既无SLE家族史,也无任何SLE相关的症状。本研究获得深圳医院伦理委员会同意及所有参与者的知情同意。基因分型采用Innogent的全基因组DNA提取试剂盒(Innogent,China),根据试剂盒说明书要求提取所收集的外周血基因组DNA。采用非标记探针高分辨率溶解曲线法鉴定样本的基因型。方法简述如下首先进行不对称PCR,20mL体系含基因组DNA模板20ng,TPCR缓存液(Takara,Japan),200mMdNTPs,O.5UrTaqDNA聚合酶(Takara,Japan),O.05mM正向引物,O.5mM反向引物和O.5mMC3封闭的探针。PCR反应在Bio-RadS1000PCR仪上进行(Bio-Rad,美国XPCR扩增条件如下94°C预变性2分钟,继之进行50个循环,包括94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸20s,最后72°C延伸5min。反应结束后转移10mLPCR产物到HR-1专用的毛细管中,再加入ImLLCGreenPlus染料(IdahoTechnology,USA)后,最后以HRMinCFX96实时荧光系统ClOOOThermalCycler(Bio-Rad,USA)ii行检测。样本先95°C变性30s,再迅速冷却到40°C30s,然后以0.3°C/s速率从55°C升温至90°C熔化,熔化曲线用Bio-RadPrecision分析软件进行分析(Bio-Rad,USA)。所述rs6887695引物序列为:正向SEQIDNO:1,反向SEQIDNO:2;非标记C3阻断探针序列=SEQIDN0:3。统计学分析采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率(MAF)在病例组与正常组之间的差异来分析SNP是否与疾病相关以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡。用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度。Z7值小于0.05认为是有统计学意义。结果非标记探针的高分辨率溶解曲线法基于C3阻断探针的高分辨熔炼曲线法用于基因分型。如图1所示,在探针区的衍生熔融曲线中可以清楚地区分rs6887695(G>C)单核苷酸多态性的三个基因型(GG,GC和CC)。而直接来源于PCR产物的衍生熔融曲线不能区分这三种基因型(图1的右半部分)。非标记探针可以增加HRMA的敏感性和精确性(图1的左半部分)。对正常熔融的非标记探针区进行进一步的分析后,我们可以清晰的鉴别出所有的三种基因型(图2A)。通过减去一个异质曲线后产生的差异曲线能更好的显示不同基因型之间的差别(图2B)。随后,我们用这两个探针分别检测所有SLE病例组和正常对照组样本。rs6887695单核苷酸多态性与SLE的相关性表I所示为SLE患者和正常人群的IL-12brs6887695基因型及等位基因频率。SLE患者和正常对照人群的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡。SLE患者的rs6887695基因型及等位基因频率与正常对照人群相比均有统计学意义。rs6887695次等位基因对SLE具有保护作用(P=0.031,OR0.78,[95%Cl0.63-0.98])。表I权利要求1.一种判定中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮相关性的方法,其特征在于所述方法是非标记探针的高分辨率溶解曲线法。2.根据权利要求1所述中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮相关性的方法,其特征在于所述方法包括如下步骤(1)基因分型取外周血基因组DNA,采用非标记探针的高分辨率溶解曲线法鉴定其基因型;(2)统计学分析采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率在病例组与正常组之间的差异来分析SNP是否与疾病相关,以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析,用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度,P值小于O.05认为是有统计学意义。3.根据权利要求2所述中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮相关性的方法,其特征在于所述非标记探针的高分辨率溶解曲线法是首先进行不对称PCR,20mL体系含基因组DNA模板20ng,fPCR缓存液,200mMdNTPs,0.5UrTaqDNA聚合酶,O.05mM正向引物,O.5mM反向引物和O.5mMC3封闭的探针。4.PCR反应在Bio-RadS1000PCR仪上进行;PCR扩增条件如下94°C预变性2分钟,继之进行50个循环,包括94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸20s,最后72°C延伸5min;反应结束后转移10mLPCR产物到HR-1专用的毛细管中,再加入ImLLCGreenPlus染料后,最后以HRMinCFX96实时荧光系统C1000ThermalCycler进行检测;样本先95°C变性30s,再迅速冷却到40°C30s,然后以O.3°C/s速率从55°C升温至90°C熔化,熔化曲线用Bio-RadPrecision分析软件进行分析;

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