微生物的分离和纯培养

关于微生物的分离和纯培养微生物:

结构都相当简单，个体多数十分微小，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。2、类群1、特点第2页,共56页，2024年2月25日，星期天病毒（无细胞结构、寄生生活）第3页,共56页，2024年2月25日，星期天细菌

电子显微镜下的结核杆菌第4页,共56页，2024年2月25日，星期天放线菌第5页,共56页，2024年2月25日，星期天真菌青霉菌酵母菌第6页,共56页，2024年2月25日，星期天原生生物第7页,共56页，2024年2月25日，星期天病毒细菌放线菌真菌原生动物2、类群无细胞结构原核细胞真核细胞第8页,共56页，2024年2月25日，星期天微生物的分离和纯培养技术是微生物最基本的实验技术，它包括培养基的制备、灭菌和消毒、接种、培养等步骤第9页,共56页，2024年2月25日，星期天内容提要：微生物及其分类培养基与各类营养物质无菌技术菌落大肠杆菌的纯化培养微生物数量的测定第10页,共56页，2024年2月25日，星期天1、概念二、培养基

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。第11页,共56页，2024年2月25日，星期天按成分不同划分天然培养基合成培养基化学成分不恒定的天然有机物牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基。用于工业生产化学成分完全了解的物质配制而成的培养基高氏1号培养基、查氏培养基。用于分类和鉴定2、分类第12页,共56页，2024年2月25日，星期天按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%，固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏

琼脂含量一般为0.2%-0.7%，观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定不加任何凝固剂，大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究半固体培养基第13页,共56页，2024年2月25日，星期天按用途不同划分基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长用于鉴别不同类型微生物的培养基，微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化选择培养基第14页,共56页，2024年2月25日，星期天3、基本营养碳源、氮源、能源、生长因子、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源(3)能源第15页,共56页，2024年2月25日，星期天（4）生长因子：

微生物生长不可缺少的微量有机物，如：维生素、氨基酸、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）。

第16页,共56页，2024年2月25日，星期天牛肉膏蛋白胨培养基应用最广泛和最普通的细菌基础培养基

培养基组分作用琼脂20g牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5gH2O定容至1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方凝固剂提供碳源、氮源、能源、生长因子碳源、氮源、生长因子无机盐水、溶剂第17页,共56页，2024年2月25日，星期天选择培养基应用加入青霉素加入高浓度食盐不加氮源不加含碳有机物的无碳培养基加入青霉素等抗生素延伸：分离酵母菌、霉菌等真菌分离金黄色葡萄球菌分离固氮菌分离自养型微生物分离导入了目的基因的受体细胞第18页,共56页，2024年2月25日，星期天鉴别培养基:加入伊红美蓝琼脂培养基（EMS培养基）鉴别大肠杆菌现象：蓝紫色金属光泽第19页,共56页，2024年2月25日，星期天4.培养基要满足微生物对环境条件的需求

：真菌微酸性（5.0-6.0）细菌中性（6.5-7.5）放线菌微碱性（7.5-8.5）大多数微生物适宜生长的温度在25-40℃之间厌氧菌需提供无氧条件pH：温度：氧气：第20页,共56页，2024年2月25日，星期天1.灭菌：

使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。三.无菌技术：

泛指在培养微生物的操作中，防止外来杂菌的污染的方法第21页,共56页，2024年2月25日，星期天灼烧灭菌干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅第22页,共56页，2024年2月25日，星期天

2、消毒

使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。煮沸消毒法：100℃5-6min巴氏消毒法：70-75℃30min或80℃15min化学药剂消毒法：酒精、氯气紫外线消毒：实验前30min超净台第23页,共56页，2024年2月25日，星期天煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂（70%酒精等）紫外线针对不耐高温的液体接种室、超净工作台能耐高温的，需要保持干燥的物品灼烧法干热灭菌高压蒸汽灭菌接种工具（接种环等）实验操作者的双手培养皿等玻璃器皿培养基消毒方法灭菌方法实验操作者的衣服第24页,共56页，2024年2月25日，星期天单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.功能：1.定义：四、菌落鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体第25页,共56页，2024年2月25日，星期天五、微生物的分离和纯培养分散成单个细胞,形成单个菌落1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（大肠杆菌分离和纯培养）计算、称量（配制固体培养基要加入琼脂）溶化调pH(注意：灭菌前调PH)分装、包扎灭菌（高压蒸汽灭菌）倒平板第26页,共56页，2024年2月25日，星期天倒平板技术1234使瓶口迅速通过火焰在火焰旁打开锥形瓶打开一条稍大于瓶口的缝隙，向培养皿中倒入约10-20ml倒入培养皿，立即盖上皿盖。等待平板冷却凝固后倒置第27页,共56页，2024年2月25日，星期天1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？

可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。问题讨论第28页,共56页，2024年2月25日，星期天

2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第29页,共56页，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。第30页,共56页，2024年2月25日，星期天

4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第31页,共56页，2024年2月25日，星期天2、接种⑴平板划线法交叉划线法连续划线法第32页,共56页，2024年2月25日，星期天1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______2、在_______旁冷却接种环，并打开棉塞3、将试管口通过火焰4、将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。5、将试管通过火焰，并塞上棉塞火焰冷却三至五7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。末端烧红8、将平板_____放入培养箱中培养。

倒置第33页,共56页，2024年2月25日，星期天问题讨论

为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第34页,共56页，2024年2月25日，星期天6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法a.梯度稀释菌液：菌液第35页,共56页，2024年2月25日，星期天b.涂布平板：滴灼试涂取0.1ml菌悬液微量移液器第36页,共56页，2024年2月25日，星期天Pourplate(3)稀释混合平板法（课本P14)第37页,共56页，2024年2月25日，星期天

将接种后的培养基和一个未接种的培养基，放入37℃恒温箱中倒置培养12h-24h,直到长出菌落为止。3、培养第38页,共56页，2024年2月25日，星期天4、实验结果观察第39页,共56页，2024年2月25日，星期天5、菌株的保存方法（1）临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。（2）长期保存：甘油冷冻管藏法搁置斜面第40页,共56页，2024年2月25日，星期天六、微生物数量的计算直接计数法间接计数法第41页,共56页，2024年2月25日，星期天（一）直接计数法

——显微镜直接计数法

将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出体积内的微生物总数。一般适用于纯培养液悬浮液中单细胞菌体的计数。优点：直观、快速、操作简单缺点：不能区分死菌与活菌，所得为总数，结果往往偏高不适于对运动细菌的计数需要相对高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜下难以观察第42页,共56页，2024年2月25日，星期天1、血球计数板

计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网。

每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。第43页,共56页，2024年2月25日，星期天****#####血球计数板计数室有两种刻度1大格=16中格25×16=400小格1大格=25中格16×25=400小格第44页,共56页，2024年2月25日，星期天

计数室边长为1mm，则计数区的面积为l×1＝1mm2，盖上盖玻片后计数室高度为0.1mm，所以一个计数室的体积为l×0.1＝0.1mm3。(注意：1ml＝1000mm3)计数室容积第45页,共56页，2024年2月25日，星期天1、稀释用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。2、镜检计数室加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则用自来水冲洗，95%乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。3、加样取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区，静置5min。注：取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生2、操作步骤第46页,共56页，2024年2月25日，星期天4、显微镜计数（以16小格×25中格的规格为例）在高倍下(40X)计数对两个计数室记数，方法：每个计数室选5个中格(4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数，求得每个中方格的平均值，再乘上25即为大方格中的总菌数，最后换算成1ml菌液中的总菌数。注：依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜计数的结果是两个计数室所记菌数的平均值5、清洗血球计数板计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。第47页,共56页，2024年2月25日，星期天3、计数方法所统计的中格的总菌数A，菌液的稀释倍数为B，则1ml菌液中：

(1)25个中方格的计数板计算公式(2)16个中方格的计数板计算公式第48页,共56页，2024年2月25日，星期天（二）间接计数法

——稀释平板计数法

将待测样品按比例做一系列稀释后，将其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定稀释度、一定量的稀释样液接种到平板上，使其均匀分布于平板中的培养基内；或是将一定量的稀释液，与溶化后冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，倾入无菌培养皿中，摇匀、静置待凝。经过培养，由单个微生物生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个菌落代表样品中的一个微生物个体。统计培养基中的出现的菌落，即可推算出样品中的活菌数。第49页,共56页，2024年2月25日，星期天能检测活菌数和杂菌数时间长，繁琐，测定值时常受各种因素影响由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成一个单菌落也可能来自样品中的2-3或更多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往偏低优缺点：第50页,共56页，2024年2月25日，星期天编号稀释菌样吸取菌样倾注平板恒温培养计数1、操作步骤第51页,共56页，2024年2月25日，星期天104105106原样10110210310