核酸的研究方法

关于核酸的研究方法一.核酸的分离，提纯和定量测定（一）DNA的分离提纯真核生物DNA与蛋白质的复合物（DNP）溶于水和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L盐溶液，用苯酚或氯仿使蛋白质变性，DNA溶于上清液。在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低温下进行，防止过酸，过碱，或机械振荡，可得高质量的DNA。第2页,共31页，2024年2月25日，星期天

（二）RNA的分离提纯RNA易被广泛存在的RNase水解，所有器皿与溶液都要经过处理除去RNase，在破碎细胞的同时应使RNaes失活，在实验反应体系中要加RNaes的抑制剂。目前常用的分离方法——为釽盐/氯化铯密度梯度离心（RNA密度>1.89，DNA密度-1.71，蛋白质密度<1.33）。另一为酸性釽盐/酚/氯仿法。第3页,共31页，2024年2月25日，星期天

（三）核酸含量的测定法利用碱基，糖和磷酸基进行测定。紫外分光光度法：利用碱基260nm紫外吸收测定核酸含量。定磷法（钼蓝比色）：浓硫酸水解核酸之磷酸，酸性条件下磷酸与钼酸形成磷钼酸，用还原剂还原磷钼酸为钼蓝，660nm比色测定含量。定糖法

RNA：核糖与盐酸共热生成糖醛，然后与地衣酚生成鲜绿色化合物，670nm比色测定含量。

DNA：脱氧核糖与二苯胺共热生成蓝色化合物，595nm比色测定含量。第4页,共31页，2024年2月25日，星期天

生物组织冷的稀酸抽提

酸溶性物质残留物有机溶剂抽提脂类物质残留物

碱法热酸法冷酸法碱降解再酸化热酸提取冷酸提取酸提取液残留物残留物酸抽提液残留物酸提取液

（RNA）（DNA）（RNA+DNA）

热酸（RNA）提取残留物酸提取液

（DNA）第5页,共31页，2024年2月25日，星期天(1)热酸法把组织预处理后的沉淀部分用稀的过氯酸（PCA）或三氯乙酸（TCA）在90

C处理15min，两种核酸皆成为酸溶性物质而抽提出来，并与大部分不溶性的蛋白质分开。

优点：无蛋白质干扰，迅速简单缺点：没有把DNA与RNA分开，准确度较差(2)冷酸法经酸和有机溶剂处理后用1mol/LPCA于4

C处理18h抽提出RNA，再用0.5NPCA在70

C处理20min抽提出DNA。各抽提液用定磷法，定糖法或紫外分光光度法来测定。

优点：可测定微量缺点：可能部分DNA混杂于RNA中第6页,共31页，2024年2月25日，星期天（3）碱法

将酸不溶的非脂类含磷化合物与1N氢氧化钠在37

C保温过夜，RNA被碱解为酸溶性核苷酸，而DNA不被分解。加入PCA或TCA酸化后，DNA即沉淀下来，上清液中为RNA的酸解产物。优点：将DNA和RNA分开缺点：RNA部分还有其他含磷化合物第7页,共31页，2024年2月25日，星期天

二.核酸的超速离心当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。1)扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。2)沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。3)利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。离心就是利用离心机转子高速度旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。第8页,共31页，2024年2月25日，星期天超速离心机第9页,共31页，2024年2月25日，星期天

密度梯度沉降平衡法1.核酸密度的测定当DNA样品的沉降速度与扩散速度达到平衡状态时，DNA形成一稳定的区带，漂浮于氯化铯密度梯度中的一定位置上。此时DNA所处的位置上的氯化铯密度等于DNA的浮力密度。用1-2个已知浮力密度的标准DNA样品作参考，与未知样品一起离心。2.测定DNA中G-C之含量G-C碱基对比A-T碱基对之密度大，含G-C对多的DNA，浮力密度大。而且G-C的百分含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系。第10页,共31页，2024年2月25日，星期天3.溶液中核酸构象的研究4.用于核酸的制备对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度为：

RNA>超螺旋DNA>解链环状DNA>

松弛环状DNA>线形DNA

也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下面是RNA。

第11页,共31页，2024年2月25日，星期天三.核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素：（1）核酸分子大小应用凝胶电泳可正确地测定DNA片段的分子大小。在同一胶上加一已知其相对分子质量的样品。电泳完毕后，经溴化乙锭染色，照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。（2）胶浓度（3）DNA的构象（4）电压（5）碱基组成（6）温度（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺作支持物。第12页,共31页，2024年2月25日，星期天核酸的凝胶电泳第13页,共31页，2024年2月25日，星期天（一）DNA的酶法测序四.核酸的核苷酸序列测定第14页,共31页，2024年2月25日，星期天DNA的酶法测序第15页,共31页，2024年2月25日，星期天DNA的酶法测序第16页,共31页，2024年2月25日，星期天DNA的酶法测序第17页,共31页，2024年2月25日，星期天Sanger法第18页,共31页，2024年2月25日，星期天Sanger法第19页,共31页，2024年2月25日，星期天第20页,共31页，2024年2月25日，星期天

（二）DNA的化学法测序Maxam和Gilbert于1977年发明1）

用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰2）

然后用哌啶切除碱基，DNA链断裂成片段，末端为特异碱基3）

变性胶电泳分离，放射自显影得到测序图谱4）

判断方法同Sanger终止法（三）RNA测序1）用特异酶切断特异碱基位置的核酸链。电泳分离得到测序图谱，同Sanger终止法。2）化学试剂断裂RNA，电泳得到测序图谱3）逆转录生成DNA，然后用DNA测序法。第21页,共31页，2024年2月25日，星期天

五.DNA聚合酶链式反应（PCR）

PCR,polymerasechainreaction是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学(molecularbiology)和基因工程(geneengineer-ing)及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定和新药品的开发等。PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地扩增(amplify)DNA某个特殊区域的技术第22页,共31页，2024年2月25日，星期天PCR过程在自然界是不存在的，它是人们对DNA复制的深刻理解而带来的产物。现代PCR概念是KaryMullis于20世纪80年代早期发明的。经过与Cetus公司的同事合作，最终导致现在广泛使用的PCR技术的诞生。

Mullis的创新点在于使用两个与DNA的两条不同链互补的寡核苷酸作为引物特异性地扩增两个引物之间的DNA区域，并且重复进行。在此同时，得到的扩增产物又可作为下一轮扩增的模板(template)，从而使得扩增产物按几何级数递增。特别重要的是，从嗜热细菌中分离的耐热DAN聚合酶使PCR从概念成为真正适用的技术。第23页,共31页，2024年2月25日，星期天1.基本要素Template:ssDNAordsDNAPrimers:oligo-nucleotides等substrates:dNTPDNApolymerase:Taqpoly

2.反应过程

denaturedsDNAssDNA92-96

Cannealing37-72

C50-58

C

extension72

C

这三个热反应过程的重复称为一个循环(cycle)第24页,共31页，2024年2月25日，星期天

PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：

即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。第25页,共31页，2024年2月25日，星期天聚合酶链式反应第26页,共31页，2024年2月25日，星期天假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增30个循环即n=30时，若X=100%，则y=230=1073741824(>109)；而若X=80%时，则y=1.830=45517159.6(>107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外线照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。

第27页,共31页，2024年2月25日，星期天六.DNA的化学合成将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设计的方向进行。5'-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，碱基上的氨基用苯甲酸保护。对3'-OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。第28页,共31页，2024年2月25日，星期天A第一个核苷酸的3'-OH与固相（树脂）结合在一起，它的5'-OH与活化的单体之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的5'-OH及碱环上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。B亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯C加入二氯乙酸除去生长链中的5'