常见病毒性产品安全检验和效力检验

关于常见病毒性产品安全检验和效力检验常见病毒性产品安全检验

安全检验技术依据及原理安全检验的内容常见病毒性产品安全检验的方法安全检验的判定原则安全检验注意事项第2页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验技术依据及原理

对人、畜环境安全是对各类兽用生物制品最基本的要求，兽用生物制品质量标准规定：对于预防、治疗等用途的不同类型的兽用生物制品必须进行安全检验。在根据兽用生物制品研究报告所制定的生物制品标准中，用一定的剂量和合适的途径接种实验动物（家兔、小鼠、豚鼠等）、鸡胚或靶动物（牛、牦牛、山羊、绵羊、马、犬、猪、鸡、鸭、鹅等），经过一定的观察期，通过对被接种动物（或鸡胚）局部或全身的评价，可以反映被接种产品的安全性。第3页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验的内容检验外源性病原污染：如致病性细菌污染或非致病性细菌数量过多（代谢产物影响安全）；外源病毒或支原体污染；活疫苗细胞培养时带毒或培养用犊牛血清有其他病毒；原材料、环境及生产过程各个环节污染。检查病毒灭活情况：对灭活疫苗而言。检查残余毒力或毒性物质：主要对活疫苗而言。残余毒力指生产制品的菌毒株本身是活的减毒株或弱毒株，允许有轻微毒力的存在，能在接种的机体内表现出来。按制品的不同，这种残余毒力的大小有不同的指标要求，测定和检验的方法也不同。

检查对胚胎的毒性：如国外猪瘟的某些弱毒株，可通过孕猪的胎盘屏障传给胚胎造成死胎、胎儿畸形或出生后发育不良等。如欧洲药典明确规定猪瘟病毒应经过对胚胎毒性的检查。第4页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验的方法△成品的安全检验方法主要是动物检验。根据产品的特点选用一定数目的规定动物（或鸡胚），按指定的接种途径接种活疫苗，不能出现规定条件之外的不良反应和异常。⊕动物的要求：敏感（一般无母源抗体）、健康、一定的品种、大小。⊕安检剂量应大于使用剂量。一般说来，活毒疫苗的安检用剂量是使用剂量的10倍，灭活疫苗的安检用剂量是使用剂量的2倍。⊕凡能以小动物作出正确判断者，则多用实验小动物（材料易得，费用较低）。△病毒类产品的安全检验方法主要有四种类型：

1、用本动物进行安全检验

2、用本动物或实验动物（或鸡胚）任选其一进行安全检验

3、只用实验动物进行安全检验

4、用本动物和实验动物同时进行安全检验第5页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验四种类型的主要产品用本动物进行安全检验（18种）：鸡新城疫灭活疫苗、鸡产蛋下降综合征灭活疫苗、鸡传染性鼻炎和鸡新城疫二联灭活疫苗、兔出血症灭活疫苗、鸡痘活疫苗（Ⅰ）、鸡痘活疫苗（Ⅱ）、鸡传染性支气管炎活疫苗（H120、H52）、鸡新城疫中等毒力活疫苗、鸡传染性法氏囊中等毒力株活疫苗（B87）、鸭温活疫苗、小鹅瘟活疫苗、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗、鸡传染性喉气管炎活疫苗、猪瘟活疫苗（Ⅱ）、伪狂犬活疫苗、山羊痘活疫苗、绵羊痘活疫苗。本动物或实验动物（或鸡胚）任选其一的安全检验（3种）：鸡马立克氏病活疫苗、鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗、鸡新城疫低毒力活疫苗。只用实验动物进行的安全检验（3种）：牛瘟活疫苗（Ⅰ）、牛瘟活疫苗（Ⅱ）、伪狂犬灭活疫苗。用本动物和实验动物同时进行的安全检验（6种）：牛口蹄疫O型灭活疫苗、口蹄疫O、A型活疫苗、马传染性贫血活疫苗、猪口蹄疫O型灭活疫苗、猪瘟活疫苗（Ⅰ）、猪瘟、猪丹毒和猪肺疫三联活疫苗。第6页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验方法举例用本动物进行安全检验：兔病毒性出血症灭活疫苗的安全检验：用体重1.5—3kg家兔4只，每只皮下注射4ml，观察7日，应全部健活。本动物或实验动物（或鸡胚）任选其一的安全检验：马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗的安全检验，下列方法任择其一：1、用鸡检：选用1-3日龄易感雏鸡或SPF雏鸡20只，其中10只各肌肉或皮下注射疫苗0.2ml（含10个使用剂量），观察14日，对照组至少存活8只，免疫组非特异死亡数不超过对照组，判疫苗合格。2、用鸡胚检：用10日龄易感鸡胚或SPF鸡胚10只，每胚尿囊腔接种疫苗0.1ml（含10个使用剂量），接种后24-68小时内鸡胚非特异死亡不超过20%，死亡鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验应为阴性，120小时收集活胚尿囊液混合，对鸡红细胞凝集试验应为阴性。只用实验动物进行的安全检验：牛瘟活疫苗(Ⅱ)的安全检验:按瓶签注明头份，用生理盐水稀释为1ml含1个使用剂量，皮下注射小白鼠5只，每只0.2ml；肌肉注射豚鼠2只，每只1ml。观察10日，均应健活。用本动物和实验动物同时进行的安全检验：

1、用体重350-450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml；用体重18-22g的小白鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5ml。连续观察7日，均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。2、用至少6月龄的健康易感牛（细胞中和抗体滴度≤1：8，或乳鼠中和抗体滴度≤1：4）3头，每头舌背面皮内注射20个点，每点0.1ml疫苗，逐日观察至少4日。之后，每头牛按推荐的接种途径接种3头份疫苗，继续逐日观察6日。均不得出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。

第7页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验的判定原则

安检期间死亡的动物经解剖明确非制品所致者可以重检，如结果可疑难以判断时，应以加倍头数的该种动物重检。凡规定用多种动物进行安检的制品（如牛口蹄疫O型灭活疫苗），每种动物均应安全合格。用小动物检验不合格者，有的规定可用使用对象动物重检。但用使用对象动物检验不合格者，不能再以小动物重检。

第8页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验注意事项

1.为保证检验的公正性，避免在对安全检验结果判定的主观影响，因此应由2名检验员共同进行。2.为防止污染，涉及疫苗稀释等操作步骤，应当在无菌条件下进行。3.动物饲养环境要符合动物饲养和检验的要求，如果环境因素不稳定，应当设置合适数量的同来源动物对照。4.检验过程要注意对实验动物进行定时观察，发病时要增加观察次数，对死亡动物要及时进行解剖。第9页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验注意事项

5.安检动物舍应当专用。并按强毒舍进行管理（如试验结束后动物应按有关规定进行处理、动物舍和饲养器具应进行全面消毒。6.如果检验结果可疑，难以判断时，应以加倍动物数量重新检验。7凡生产口蹄疫疫苗的生物制品企业，其生产的猪用活疫苗，均需用乳鼠进行安检；凡使用猪瘟强毒或污染猪瘟强毒的生物制品企业，其生产的猪用活疫苗均用无猪瘟抗体的敏感猪进行安检。（方法见规程2000版P20）第10页,共30页，2024年2月25日，星期天安全检验注意事项

8.安全措施：（1）检验过程中应注意防止对检验人员和环境的污染，检验人员必须穿戴工作服、口罩及相关的安全防护器具，撒在操作台、地面的产品要进行消毒处理。检验完毕后开封的产品均要进行高压灭菌处理。（2）发病或死亡动物、粪便及其污染物必须严格按照“防止散毒”等相关规定处理。（3）怀孕或手部有外伤的检验人员禁止解剖死亡动物（4）在检验过程中发生烈性传染病或人员意外时，必须迅速通知有关部门采取紧急措施。第11页,共30页，2024年2月25日，星期天常见病毒性产品效力检验

效力检验的内容效力检验原理及方法效力检验应注意的问题第12页,共30页，2024年2月25日，星期天效力检验的内容

免疫原性：制备制品的毒种免疫原性应良好。制备疫苗的毒株必须要与流行株相对应，才能起到好的免疫效果。制品的免疫持续期：理想的制品应具有较长的免疫持续期，免疫持续期过短的制品应考虑增加免疫接种的次数。抗原的稳定性：一般灭活苗的热稳定性较好，弱毒苗较差，但也可随制品的种类而已。抗原量的测定：活疫苗的效力取决于接种动物的毒量，即一定量病毒才能在体内增殖，促使机体产生免疫应答，若数量不够，则达不到免疫效果。灭活苗同样也需要一定的抗原量才有效。所以应测定制品的最小免疫量。但制品的抗原量并非越多越好，应适量，否则会出现副反应。第13页,共30页，2024年2月25日，星期天效力检验方法之一：攻毒保护试验1、攻毒保护试验原理：使用疫苗进行接种的最终目的是使接种过的动物获得抵抗强毒病原感染的能力。因此，对靶动物或已经建立的实验动物模型进行接种后，用强毒病原进行人工攻毒，根据动物的保护情况判断疫苗的效力，是用以检验疫苗效力的最直观方法。第14页,共30页，2024年2月25日，星期天效力检验方法之一：攻毒保护试验2、攻毒保护试验方法：按照疫苗的特点和使用对象选择一定数目指定年龄（或体重）无特异性抗体的易感健康动物，按照规定的途径和剂量给动物接种疫苗。除有特殊规定外，一般注苗3—4周后连同条件相同的对照动物用指定的强毒和毒量按要求进行攻毒。攻毒后在规定的时间内观察动物的健康状况，不应出现规定以外的不良反应和异常。第15页,共30页，2024年2月25日，星期天3、采用攻毒保护试验方法的常见疫苗如下（17种）：鸡新城疫灭活疫苗、鸡传染性鼻炎-鸡新城疫二联灭活疫苗、伪狂犬病灭活疫苗、兔病毒性出血症灭活疫苗、猪口蹄疫O型灭活疫苗、牛口蹄疫O型灭活疫苗、猪瘟活疫苗(I)、猪瘟活疫苗（II）、鸡传染性喉气管炎活疫苗、鸡传染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、猪瘟、猪丹毒、猪多杀性巴氏杆菌三联活疫苗、伪狂犬活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡新城疫中等毒力活疫苗、鸡新城疫低毒力活疫苗、鸡新城疫-鸡传染性支气管炎二联活疫苗、鸭瘟活疫苗。

注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第16页,共30页，2024年2月25日，星期天4、攻毒保护试验效检方法举例牛口蹄疫O型灭活疫苗效力检验：用至少6月龄的健康易感牛（细胞中和抗体滴度≤1：8，或乳鼠中和抗体滴度≤1：4）15头，分为3组，每组5头，将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于颈部肌肉注射5头牛。接种21天后，连同条件相同的对照牛2头，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫O型病毒强毒，每点0.1ml（共0.2ml，含10000ID50）。连续观察10日。对照牛应至少3蹄出现水泡或溃疡。免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，而其他部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫水泡或溃疡判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50，每头份疫苗应至少含3PD50。第17页,共30页，2024年2月25日，星期天效力检验方法之二：病毒含量测定1、病毒含量测定原理：病毒含量的高低直接反映了产品的质量。因此用动物（鸡胚、细胞培养物）接种测定病毒性活制品的病毒含量可作为评定效力高低的依据。第18页,共30页，2024年2月25日，星期天效力检验方法之二：病毒含量测定2、病毒含量测定方法：每批疫苗按瓶签注明的头份用指定的稀释液作适当稀释后，通常选择三个最佳稀释液，按规定的途径和剂量接种一定数目指定的实验动物（细胞、鸡胚），在规定的时间内观察，根据动物（细胞、鸡胚）对疫苗的反应情况来计算疫苗的LD5O（TCID50

、ELD50、PD50、EID5O）或蚀班数（PFU），以此来判定疫苗的效力。第19页,共30页，2024年2月25日，星期天3、病毒含量测定常见疫苗（12种）：口蹄疫O、A型活疫苗、山羊活疫苗、鸡传染性喉气管炎活疫苗、鸡传染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡新城疫中等毒力活疫苗、鸡新城疫低毒力活疫苗、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗、鸡痘活疫苗（Ⅰ）、小鹅瘟活疫苗、鸡马立克氏病活疫苗、鸡马力克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗。注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第20页,共30页，2024年2月25日，星期天4、病毒含量测定效检方法举例口蹄疫O、A型活疫苗单价苗的效力检验：将疫苗用PBS做10倍系列稀释，O型苗以10-5、10-6、10-7三个个稀释度，A型苗以10-6、10-7、10-83个稀释度，各皮下接种3—4日龄乳鼠4只，每只0.1ml，观察4-5日，根据乳鼠发病死亡数计算LD50，每0.1mlO型苗≥105.5LD50，A型苗≥106.5LD50，判为合格。

山羊痘活疫苗效力检验方法之一：按瓶签注明头份，用生理盐水稀释测其毒价，每头份病毒含量应≥103.5TCID50。第21页,共30页，2024年2月25日，星期天效力检验方法之三：血清学试验1、血清学试验原理：根据相关血清学检验的原理，检验抗体水平和抗原活性，从而评定产品的效力。病毒性产品主要采用以下两种：（1）抗体效价测定：动物体的免疫系统能够对进入体内的外源物质进行吸收、加工处理和递呈，使有关淋巴细胞活化并产生特异性抗体。在部分疾病的免疫防治中，以这种体液免疫机制为主，其特异性抗体水平与攻毒保护率之间有一定平行关系。在这种情况下，对本动物或已经建立的实验动物模型进行接种后，通过适宜的血清学试验检测动物的抗体水平，可以作为判断疫苗效力高低的有效方法。第22页,共30页，2024年2月25日，星期天效力检验方法之三：血清学试验2）中和试验：病毒与适量抗体完全中和后，接种敏感动物或细胞，可不受侵害而获得保护。如果用一定抗原分别与系列稀释的抗体（血清）中和，可得到使50%动物或细胞获得保护的最高血清稀释度，即血清的中和效价进而评价某疫苗（抗原）的效价或试验动物的相关抗体是否符合规定。2、血清学试验方法：血清学相关方法，如红细胞凝集抑制试验、中和试验、补体结合试验等。第23页,共30页，2024年2月25日，星期天3、血清学试验常见疫苗抗体效价测定：主要有鸡产蛋下降综合征灭活疫苗（HI抗体测定）、马传染性贫血活疫苗（补体结合试验和琼脂扩散试验）。中和试验法：鸡新城疫-鸡传染性支气管炎二联活疫苗、小鹅瘟活疫苗、伪狂犬病灭活疫苗。注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第24页,共30页，2024年2月25日，星期天4、血清学试验效检方法举例鸡产蛋下降综合症效力检验：用3-6周龄的健康易感鸡（HI抗体≤1：4）10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml,另取10只鸡饲养不免疫；3-5周后采血，测定HI抗体，免疫鸡HI抗体几何平均滴度≥1：128，对照鸡抗体HI抗体效价应≤1：4。小鹅瘟活疫苗效力检验方法之一；取健康成年鹅4只，分别采血1ml,分离血清并混合备用。然后注射1个使用剂量的疫苗，每只鹅1ml，21-28日后采血，分离血清混合，将接种疫苗前后的2次血清分别与小鹅瘟GD株在鸭胚中作中和试验。两次ELD50值之差≥2对数值为合格。第25页,共30页，2024年2月25日，星期天其他效力检验方法热型反应和发病观察：某些疫苗以适当剂量及途径接种实验动物（本动物、鸡胚）后，可产生典型的热型反应或特征症状及病理变化，借以判定疫苗的效力。主要产品如下：山羊活疫苗、绵羊痘活疫苗、牛瘟活疫苗（Ⅰ）、牛瘟活疫苗（Ⅱ）、猪瘟活疫苗(I)、猪瘟活疫苗（II）、鸡痘活疫苗（Ⅰ）、鸡痘活疫苗（Ⅱ）。注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第26页,共30页，2024年2月25日，星期天方法举例：

牛瘟活疫苗效力检验：按瓶签注明头份，用生理盐水稀释为1ml含0.01个使用剂量，耳静脉注射1.5-2kg家兔4只，每只1ml。应出现典型牛瘟兔化弱毒的临床反应和病理变化。（症状：体温升高，食欲减退，呼吸急迫，鼻分泌物增多，精神不佳，怀孕后期母兔，间或流产；感染后3-14日可有死亡，内脏可见明显病理变化。