进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别 PCR法和实时荧光PCR法

进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法本标准规定了纺织品中山羊绒，绵羊毛鉴别的PCR和实时荧光PCR方法。本标准适用于纺织品中山羊绒、绵羊毛PCR法和实时荧光PCR法的定性鉴别。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。聚合酶链式反应polymerasechainreaction:PCR一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以4种单核苷酸(dNTP)为底物，通过变性一退火一延伸的循环反应，使极少量的DNA的特定片段，在短短几小时内扩增上百万信。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepair)Ct值；每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数(eyclethreshold)DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)DTT;二硫疏糖醇。dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)用试剂盒法提取样品DNA。针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针，通过单一PCR、实时荧光PCR技术，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判定该样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。6.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。6.2组织和毛发提取试剂盒(与DNA1QT”系统结合使用):参见附录A中A.1。”6.32×TagPCRMasterMix;0.1U/pL.TagDNA聚合酶，500gmol/L(pH8.3),100mmol/L.KCl,3mmol/L.MgCl,其他稳定剂和增强剂，-20℃保存。6.4PremirErTag'"(PerfertRenlTime6.6琼脂糖。6.7溴化乙锭。6.105×TBE缓冲液。7仪器与设备7.1冰箱：4℃~-20℃。7.2天平：感量0.001g。7.3分析研磨机。7.5微孔干溶器或水溶锅。7.6瞬时离心机。7.7润旋仪。7.81.5mL磁分离架。7.9微量可调移液器及枪头：10μl、207.101.5mL离心管。7.11PCR薄壁管。7.12实时荧光PCR光学反应管。7.13超净工作台。7.15实时荧光定量PCR仪。7.16电泳装置。7.17凝胶成像仪。纱线：从不同的管纱，简纱或绞纱上随机取样，共取约1g的纱样。织物：从不同位置剪取，共取约1g的织物。℃内参基因5*-GCG/ATACGCAATCTTACGA5°-CTGG/TCCTCCAATTCATG℃5*-ATATCAACACACGAGAGG5°-TTTAAACTGGAGAGTGG11.2.2PCR反应体系2×TagPCRMasterMix12.5pL,10pmol/L引物各0.5pL,DNA模11.2.3PCR反应条件94℃,5min;94℃,30s.退火温度(表1),30s,72℃,30s,40个循环：72℃,5min。11.2.4PCR产物的检测将适量5×TBE稀释成0.5×TBE溶液，配制2.0%琼脂糖凝胶。取15μLPCR产物，点样进行电泳，并加DNAmarker点样以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm~5V/cm长度，电泳时间根据溴酚监的移动位置来确定。电泳结束后，将凝胶置溴化乙锭溶液(10pg/gL)中浸泡30min。用凝胶成像系统观察，拍照，记录与分析电泳结果。11.2.5PCR结果及判断阳性对照出现预期大小的扩增条带，阴性对照和空白对照均未出现条带；待测样品末出现预期大小的扩增条带，判断结果为阴性。待测样品出现预期大小的扩增条带，判断结果为可疑阳性，需进一步确证。11.2.6结果确证实验可疑阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与附录B中的相应序列进行比对，同源率达100%,可确证为阳性结果，或采用实时荧光PCR法进行确证。11.3实时荧光PCR法11.3.1引物及探针所用的引物，探针见表2,用TE溶液(pH8.0)稀释至10pmol/L,,-20℃保存备用。℃内参基因5'-FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCG七5'CGCCCTCCAAATCAATAA-3’5¹FAM-ACGTGTTAAAGCATACATC-T5'-ATATCAACCACACGAGAGGS'-TTTAAACTGGAGAGTCGG5'FAM-AAACCAAGATATAGCTTAATT-TA11.3.2PCR反应体系PremixExTagt(PerfectRealTime)(2×)12.5gL,10mmal/L引物，探针各0.75pL,ROXReferenceDyeⅡ(50×)0.5pL,DNA模板5pL,ddH₂O4.75pL。11.3.3PCR反应条件95℃,30s;95℃.5s,退火温度(表2),35s,40个循环。11.3.4结果分析反应结束后，应设置无效基线范围，基线范国选择在3～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值=40为准。设置阈值后，分析样品的检测结果。11.3.5结果判断待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值大于或等于40,内参照基因检测Cr位在20～30之间者，阴性对照。阳性对照和空自对照结果正常者，则可判定该样品未检出山羊成分，绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值小于或等于36,内参照基因检测Ct值在20～30之间者，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出山羊成分，绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出山羊成分、绵羊成分；再次扩增后结果Ct值大于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出山羊成分、绵羊成分。12防止污染的措施7(资料性附录)试剂盒及试剂A.1组织和毛发提取试剂盒(与DNAIQ”系统结合使用)(推荐使用Promega公司产品)A.1.1组成(100次)温育缓冲液(ineubntionbuffer)50mL蛋白酶K(proteinaseK)二硫疏糖醇(DTT)5.0g2×洗涤缓冲液(washbuffer)30mL裂解缓冲液(lysisbuffer)40mL.洗脱液(elutionbuffer)树脂(resin)0.9mLA.1.2试剂配制A.1.2.1蛋白酶K储存液向冻干的蛋白酶K瓶中加人5,5ml,温育缓冲液，轻摇使之完全溶解。此蛋白酶K储存液的终浓度为18mg/mL。将蛋白酶K储存液分装成小包装，可在一20℃保存至1年，反复冻融不要超过5次。使用前将蛋白酶K放置在冰上融化及保存。将5gDTT溶于无核酸酶的水中至终体积为32.4mL,则DTT的终浓度为1mol/L,分装成小包装使用并保存在-20℃,A.1.2.31×洗涤缓冲液向2×洗涤缓冲液中加入15ml.95%～100%的乙醇和15mL异丙醇，混匀，室温保存。A.1.2.4裂解液确定所需的裂解液的总量，每100pL.裂解缓冲液中加入1gl.1mol/LDTT,颠倒几次混匀，室温保存一个月。A.2PremirExTag””(PerfectRealTime)(2×)试剂盒组成PremirExTag"(PerfeetRealTime)(2X)1.0ROXReferenceDye(50×)在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H₂O),剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0,然后定容至1L.分装后高压灭菌。0.5mol/L.EDTA(pH8,0)(资料性附录)B.1绵羊序列ATATCAACCACACGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATACTGGAAAGCTTGGATAAACCAAGATATAGCTTAATTAAAGCATCTAGTTTACACCTAGAACACATTATGAGTATCTTGAACTATACCTAGCCCAAAATCTCCCACTCTCCB.2山羊序列CGCCCTCCAAATCAATAAGACT/CAAGAGGAGCAOG/TTCGT