松材线虫检疫鉴定方法

5.20.1%硫酸链霉素(配方见附录A中A.6);5.3TAF双倍液(配方见附录A中A.1);5.4棉蓝-乳酚油(配方见附录A中A.2);5.5福尔马林甘油液(配方见附录A中A.3);5.6封片蜡(配方见附录A中A.4):5.7PDA培养基(配方见附录A中A.5);5.8灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。6.1直观检验对应施检疫物观察材质是否干燥，木质部有否蓝变，有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。6.2.1选取材质干燥无检脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕迹的松木或其加工制品，若无上述特征时可随机抽样。抽样数量为每批总件数的0.5%~5%,最低不得少于三件，不满三件时全部抽取。6.2.2将所抽的样木锯成5cm左右的木段，或用木工钴多点钻取木屑(不得少于10g/份),标号后即送样至实验室检验。6.2.3取样时注意选取靠近虫道、蛹室的部位，钻取木屑时要注意先把取样部位的树皮剥净。6.2.4必要时可将样木整件带回实验室检验。7实验室检验7.1松材线虫的分离松材线虫分离方法见附录B。在体视显微镜下观察钟面皿中收集的线虫分离液，发现线虫后用挑针挑取或用50gL微量移液器吸取线虫并制成临时水玻片，在显微镜下观察。7.2.1临时水玻片的制作在载玻片上滴加一小滴水液(约50μL)。将线虫挑至水滴中央，沉底。从水滴正上方加盖玻片，在酒精灯上用1s的振幅周期通过10次左右，使线虫恰好被杀死。7.2.2每份样品的分离液中线虫含量在20条以下的，全部制成临时水玻片境检；20条以上时，通过解剖镜观察选取各类各虫态线虫制片镜检，每类每虫态线虫至少镜检三条以上。7.3松材线虫的培养分离得到的松材线虫雌、雄成虫数量极少或仅发现幼虫时，须进行培养获得足够的雌、雄成虫，以进一步鉴定。培养方法见附录C。7.4松材线虫的虫体测计7.4.1标本制作在进行虫体测计时，需杀死、固定检材线虫，确保虫体各器官定型，并制作玻片标本，供虫体测计。松材线虫标本的制作方法见附录C。7.4.2虫体测计分别测量雄、雄成虫虫体的长度、宽度及有关器官的长度，并记录测量的数据，然后按德曼公式(DeManformula)计算各种比值，用相应的符号表示。测计方法见附录C。8形态鉴定特征8.1松材线虫雄虫(见图1)热力杀死后虫体呈“J”形；头部缢缩：口针细长13μm左右。基部稍增厚但不形成基部球：中食道球卵圆形，占体宽三分之二以上，食道腺长叶状覆盖在肠背面：排泄孔位于食道和肠交接处：半月体在排泄孔后三分之三体宽处，民部侧面观呈鸡爪状向腹部弯曲，交合刺大，弓状，成对。喙突显著,交合刺远端有盘状突，端生交合伞卵圆形(背、腹面观)。8.2松材线虫雌虫(见图1)热力杀死后呈弓形，前部特征和雄虫相似。阴门开口于虫体中后部70%左右处，开口处有向后延伸的阴门前唇——阴门盖。尾部亚圆锥状，尾端指状，偶尔有尾尖突，尾尖突位于虫体尾部正中间，长约1松材线虫幼虫分为繁殖型幼虫和分散型幼虫，其形态特征可作为辅助特征应用。8.3.1繁殖型幼虫无生殖器官，其他形态特征同成虫。处于生活期，体内脂肪颗粒少，肠内食物多，结构模糊，体色呈暗色。繁殖型3龄幼虫蜕皮成繁殖型4龄幼虫；繁殖型4龄幼虫蜕皮成为成虫。8.3.2分散型3龄幼虫其形态上与相应龄期的繁殖型幼虫相似，但体内脂肪颗粒多，表皮增厚，食道部分因退化，有时表现不清晰。8.3.3分散型4龄幼虫(又称持久型幼虫)该类型幼虫食道严重退化，口针不易被发现，虫体表皮胶质多。8.4松材线虫的测计值(见表1和表2)松材线虫的虫体测计值可反映其器官的位置、器官与器官的比例，可作为辅助鉴定特征应用。不同疫区的松材线虫虫体测计值有一定的差异。C一雄虫尾部；D一雄虫尾部((腹面观):E—交合刺(腹面观);F一雌虫前部：G_雌虫阴门；H-J一雌虫常见的三种尾型(H—标准尾型、I-J—略有尾尖突)。图1松材线虫Bursaphelench表1各疫区松材线虫雄虫测计值abC(28,6~(27.0~日本(590,~中国(17.1~(489,~(17.2~(20.8~(17.1~(26.0~表2各疫区松材线虫雌虫测计值日本日本中国(13.5~(15.4~(10.4~(13.0~41.0土3,378.5松材线虫和拟松材线虫的区别(见附录D)伞滑刃属中松材线虫和拟松材线虫(BursaphezenchusmvcronatusManiya&Enda,1979)形态极为相似，是鉴定时极易混淆的两种线虫，要注意两者的区别(见表3)。表3松材线虫和拟松材线虫主要形态区别BarnaphelenchurrylophiBursaphelenchusmucrona(大于3μm)(大于3pm)以雌虫、雄虫的形态特征为依据，符合上述形态特征的，可判定为松材线虫。10.1经鉴定为松材线虫的，则将剩余的线虫杀死、固定，放入含有线虫保存液(TAF液)的瓶中保存，也可制成水久破片保存，并贴上标签。10.2对含有线虫的木样材料，经登记后妥善保存，并做好标识，标明基本情况，如截获日期、截获人、输出入国别/地区、运输工具名称等，木样至少需保留六个月，以备复验。保存期满后视情况作销毁处10.3需保留具有雌、雌成虫形态特征的显微照片各三张，雄虫包括：线虫整体，交合刺形状，端生交合伞形状；雌虫包括；线虫整体，阴门盖形状，尾部形状。(规范性附录)标准中涉及的试剂配置方法A.1TAF双倍液(三乙醇胺福尔马林双倍液)福尔马林(40%甲醛)三乙醇胺蒸馏水A.2棉蓝一乳酚油液配制含染料的乳酚油，按5X106～10X105的比例另加事先溶好的棉蓝水溶液。乳酚油的配制成分如苯酚(液体)蒸馏水A.3福尔马林甘油液(PG液)福尔马林(40%甲醛)蒸馏水由3份蜂蜡与1份凡士林融化后混合而成。A.5PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)马铃薯gg水将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯渣，加水补足1.000L,然后加葡萄糖和琼脂。加热使琼脂完全溶化后，乘热用纱布过滤，或者用滤纸和保温漏斗过滤。而后分装试管或三角瓶，加棉花塞后灭菌备用。A.60.1%硫酸链霉素硫酸链霉素灭菌水(规范性附录)松材线虫分离方法B.1漏斗分离法将漏斗(直径10Cm~15cm)架在漏斗架上，下面接一段10cm长的橡皮管，橡皮管上装一个截流夹具体操作步骤如下：将10g木屑或细木片用双重纱布包好，放在盛满清水的漏斗中(由于线虫的趋水性和自身的重量，线虫离开植物组织，在水中蠕动，最后沉降到漏斗末端的橡皮管中):24h后打开弹簧夹，用离心管或小瓶接取约5ml的水样；静置20min左右或1500r/min离心3min,倾去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。用此方法分离松材线虫时，分离时温度应保持在25℃左右，温度太高或太低均会影响松材线虫的分离效果。图B.1漏斗法分离线虫装置示意图浅盘分离法装置由两只不锈钢浅盘、线虫滤纸或宽幅卫生纸组成。一只浅盘口径小，可套放于另一只浅盘内，并且其底部用粗筛网(10目)取代，被称为筛盘；另一只是正常浅盘(图B.2)。将线虫滤纸或1层～2层卫生纸平辅在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分；将待分离线虫的木屑或薄木片放置其上；从两只浅盘的夹缝中注水，至流没供分离的材料为止；在25℃左右下放置12h~24h后，用烧杯收集浅盘中水，并将烧杯中的水连续通过40目和500目的套筛，将500目标准筛上的含线虫的残留物冲洗到小培养皿中镜检。2—线虫滤纸：3—筛盘；4—底盘。B.3改进型漏斗法改进型溷斗法分离检材线虫，包容了浅盘法和漏斗法各自的优点，在提高了漏斗法分离效率的同时，又解决了浅盘法必须使用套筛而使树脂及杂物经常堵赛500目筛的筛孔的问题。改进型漏斗法分离装置，由1只较大并类似于贝尔曼漏斗的玻璃或有机玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘法装置相似(见图B.3)。将线虫滤纸或1层~2层卫生纸平放在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分；将待分离线虫的木屑或薄木片(2mm左右)放置其上；从筛盘下部的空隙中将水注入分离器中，以淹没供分离的材料为止：在15℃~25℃下放置1d~2d后，打开弹簧夹，用离心管接取约5L的水样；静置20min左右或1500r/min离心3min,吸去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。”2—线虫滤纸；3—筛盘：4—基座：5—橡胶管：6—截流夹。图B,3改进型漏斗分离松材线虫装置示意图(资料性附录)松材线虫培养、标本制作和虫体测计方法c.1松材线虫培养方法当分离得到的松材线虫数量较少或未分离到雌雄成虫时，可通过培养获得大量成虫，进行进一步鉴C.1.1病木保温保湿培养将样品锯成小段，置于烧杯中加少量清水，使木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在25℃条件下保温保湿培养3d~4d,倒取杯中水液，可获得较多雌雄成虫；或将样品木段适当浸湿，放于塑料袋里，扎紧袋口，置于25℃培养箱中3d～4d取出重新分离，可获得较多雌雄成虫。C.1.2单异活体培养用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)或多毛孢(Pestalotiasp)培养线虫。以灰葡萄孢为例：制取马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)培养基平板。挑取PDA斜面上的一小块灰葡萄孢，移在PDA平板上，保持25℃恒温及黑暗条件，经4d～5d菌丝长满平板。在长满灰葡萄孢的PDA平板上接种经0.1%硫酸链毒进行表面消毒的2条以上的幼虫，在25℃恒温箱中培养5天可获得足够用于鉴定的线虫：10天左右，可繁殖产生大量线C.2松材线虫标本制作方法解剖镜下用线虫挑针挑取线虫，转移至玻片上的25L水滴中，使线虫沉底并位于水滴中央。在水滴边缘放置3mm~5mm长、直径略大于线虫体宽的玻璃纤维丝二根至三根。从水滴正上方加盖玻片，在酒精灯火焰上用1s的振幅周期通过10次～20次，使线虫恰好被杀死为止。待盖玻片周围溢出的水渍干燥后，用透明指甲油封固，30min后加封一次。C.2.2半永久标本将分离所得的线虫液，转移至离心管中，2000r/min离心3min。吸去上部清水并保留底部3mm~~4mm线虫液，置于53℃热水中15min杀死线虫，特线虫液冷却后，加入等体积的TAF双倍液固定48h以上。固定后用上述方法再次离心，用50μL微量移液器吸取离心管底部线虫液，滴加进装有2mlL～3L棉蓝一乳酚油的钟面皿中，置恒温烘箱中45℃脱水24h。在载玻片上加上封片蜡圈，用挑针加一小滴甘油于蜡圈中心位置。解剖镜下挑取脱水后的目标线虫于甘油中，使其沉底并位于甘油滴中心位置。在封片蜡圈上放置盖玻片后，转移至控温电热平板上，保持75℃使蜡完全融化，取下并自然冷却后用透明指甲油加封一次。在显微镜下鉴定并确认为松材线虫标本后贴上标签，注明标本中松材线虫的虫龄、数量、寄主、寄主产地、截获口岸及鉴定人等。同上述方法杀死，固定线虫后，用“甘油缓漫脱水法”制作松材线虫永久玻片。在钟面皿/培养m内注入2ml～3L福尔马林甘油液，在其中加2滴苦味酸饱和液制成脱水液，用微量移液器吸离心后的离心管底部线虫液50μl,滴加在上述脱水液中。以同样的小染色皿盖好线虫皿后，放置在43℃温箱中或干燥皿中6周～8周，让水和甲醛等缓慢蒸发，期间由于皿中的水和福尔马林的蒸发，需要及时补充在同一温箱中预热的甘油福尔马林液。在不断“燕发一补充”过程中，血内的甘油愈积愈多，线虫体内的水分愈来愈少，直至线虫完全脱水为止。脱水后的线虫用C.2.2中方法制片并加贴标签。C.3松材线虫虫体测计方法本标准采用德曼公式(DeManformula)对松材线虫进行虫体测定，具体测定项目和方法如下：L——体长(mm或μm,头端至尾端的中线距离，b——体长除自头端至食道与肠的连接处的长度；c——体长除尾长(μ门或泄殖腔口至尾端，不包括尾尖突):V——头端至阴门的长度乘100除体长；T——睾