牛结节疹检疫技术规范

牛结节疹检疫技术规范8.3.1.2用培养液稀释病毒至100TCIDo/50gL。加入50μL工作病毒抗原置滴定试验孔中。每一块96孔培养板可检验32份血清。8.3.1.3将培养板置5%的二氧化碳培养箱37℃感作1h。8.3.1.4辑孔加已培养好的3×10°ml.细胞悬液100μl.。8.3.1.5置37℃二氧化碳培养箱进行培养9d,连续观察CPE。8.3.1.6同时做病毒回归试验以测定病毒实际TCIDko,8.3.2对照8.3.2.1阳性血清和阴性血清均按被检血清进行。8.3.2.2病毒回归试验，即重新测定病毒的TCIDn。将病毒抗原做10倍系列稀释至10-*,每个稀样度加4孔，每孔加50pL,补加50pL.培养液，再加入细胞悬液100pL,计算试验所用50pL.病毒液含有实际的TCIDo。8.3.3结果判定8.3.3.1用倒置显微镜从第4大起每天观察细胞CPE变化，当病毒抗原对照、阴性血清对照均出现CPE.阳性血清对照无CPE,待检血清对细胞无毒性，对照细胞生长正常，抗原实际用量在50TCID/50gL~150TCID/50pL.范围内方能判定结果，第9天终判，抗体效价滴定判读标准是以待检血清最高稀释度50%保护为该待检血清的中和效价，以能保护细胞免于破坏的血清最高稀释度为该血清滴度。8.3.3.2中和滴度大于等于115为阳性，小于115为阴性。8.3.3.3每次试验中，阳性对照血清滴度不应比其已知效价差1个滴度以上，回归滴度变化应在8.3.4结果解释通常血清中和试验是最特异的血清学试验方法，但LSD感染后主要是细胞免疫，阴性结果免疫应答较温和，并非意味着动物没有产生抗体，而动物感染LSD病毒仅产生低水平的中和抗体，因而不够敏感。因此在采用中和试验结果的同时，结合临床症状(参见附录B)等方法做最终判定。(规范性附录)EDTA用量为1.5mg/mL~2.5mg/ml.血液终浓度。Hank's平衡盐10倍浓缩液硫酸镁(MgSO₂·7H:O)氯化镁(MgClg·6H₂O)贮存于室温或4℃。使用前，取Hank’s平衡盐10倍浓缩液，用灭菌双蒸水稀释至工作液，并含复合抗生素及10%甘油，即为10%甘油运输液。B液磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)以0.104MPa~0.112MPa15min高压灭菌A液和B液。贮存于4℃或室温。A.5复合抗生素青霉素销盐，每毫升含1000国际单位(IU/ml.),硫酸链霉素1mg/mL,制霉菌素100IU/ml.,或两性霉素2.5μg/mL,和新霉素200lU/mL。A.6苏木精-伊红染色苏木精氧化汞乙醇硫酸铝钾(或硫酸铝铵)去离子水200mla)在酒精内溶解苏木精，在水内溶解硫酸铝钾，加热助溶；b)混合苏木精和硫酸铝钾溶液，尽快煮沸；c)加入氧化录，此时溶液变成深紫色；d)在自来水中迅速冷却；e)滤纸过滤：f)装入瓶中盖紧，室温保存。A.6.2使用方法a)制备涂片(或盖玻片细胞培养标本)在空气中干燥；b)用磷酸缓冲藏洗3次，以去除蛋白：c)在Zenker's液(配方见第A.7章)中固定12h~36h;d)自来水中洗30min;e)80%乙醇中脱水：f)转到0.5%碘液(用95%酒精配制)5min;g)转到0.5%硫代硫酸钠水溶液中5min;h)在自来水中洗5min:i)用苏木精染色10min:j)在稀释的氨水中分化，直到呈蓝色(约10min);k)用0.5%伊红复染2s~5s;1)在三缸95%乙醇中脱水(即3次),然后很快转到二缸纯乙醇中(即2次)1m)在二甲苯中脱脂2次，每次2min~5min;n)用中性香胶固封。氯化汞硫酸钠次氯酸钾去离子水(资料性附录)牛结节疹(lumpyskindisease,LSD)是牛的一种痘病，又称疙瘩皮肤病、结节性皮肤病、伪荀麻疹等，是牛疙瘩皮肤病病毒(lumpyskindiseasevirus)引起的牛的一种急性、亚急性或慢性病毒性传染病。该病可导致牛的产量下降及奶牛产奶量下降，还可损坏皮张。结节性皮肤病(LSD)1929年首次在赞比亚发现，1943年传到博茨瓦纳，然后又传到南非，800多万头牛受影响，感染牛死亡率达20%,造成重大的经济损失。本病在1988年以前仅局限于非洲撒哈拉以南，后来传到非洲北部的埃及。于1988年埃及首次发现本病。在非洲以外，实验室证实只有1989年在以色列暴发了一次，所有感染牛和接触牛全部被扑杀，其余牛注射疫苗后，疫情得以消灭。1993年在非州的巴林，留尼旺岛有暴发的报告，但没有分离到病毒。本病病毒属痘病毒科(Poxviridae),山羊痘病毒属(Capriparvirus),代表株为Neethling株，核酸类型为DNA。LSD是由山羊疸病毒属病毒株引起的，其抗原性与引起绵羊痘和山羊痘的毒株之间的抗原性难以区别。然而，LSD具有与绵羊痘和山羊痘不同的地理分布，这表明牛型山羊痘病毒株不感染山羊和绵羊，在它们之间也不传播。LSD病毒主要通过昆虫传播，自然界中在没有媒介昆虫的情况下，很难接触传播。在给子家兔、绵羊、山羊、长颈鹿和黑羚羊经皮内人工感染后，在局部形成轻度