进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程

进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程本标准适用于对松材线虫疫区国家和地区输华货物的所有针叶树原木，木制品和木松材线虫是松树等针叶树上的一种寄生线虫，隶lenchida),滑刃科(Aphelenchoididae),伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae),伞滑刃线虫属(Bursaphelen-在松树木材中，由于长喙壳属Ceratocystisspp.,色二孢属Diplodia线虫的天牛称之为媒介天牛。扩散性3龄幼虫(Lπ)dispersallarvaeLr在秋末冬初，罹病松树木质部内松材线虫蜕变为扩散性3龄幼虫(L₁),和普通3龄幼虫(L)相比，Lg角质膜显著增厚，体腔内含物浓稠，肠内积聚类胎小滴，特别耐饥饿、耐干燥和耐低温等不良环境。持久性4龄幼虫(Ly)dauerlarvaeLy在媒介天牛幼虫越冬和化蛹期间(冬季至春季),Lm不断向天牛蛹室集中，并且在媒介天牛羽化时大量的L1蜕变为持久性4龄幼虫(Lm)。Lm形态变化很大，除角质膜增厚外无口针，食道退化，头圆丘形，尾端明显指状，肠内积聚类脂，贮存糖原。Ly特别抗干燥，体表覆盖保护性胶粘物适于媒介天牛的传播。下列符号适用于本标准。N——测计的样本数目L——虫体体长(pm或mm)a——体长(L)/虫体最大体宽b——体长(L)/唇至食道腺基部的长度C——体长(L)/尾长(肛门至尾尖)V——头顶至阴门的长度/体长(L)×100%S——口针长度(pm)S,—交合刺长度(pm)松材线虫在松树体内的分布与媒介天牛的活动有关，当松材线虫危害松树并导致松树死亡后，为适应不良的环境，病树木质部内松材线虫蜕变为扩散性3龄幼虫(Lπ),当媒介天牛化蛹后，Lr则向蛹室聚集，并在媒介天牛羽化时大量的Lm蜕变为持久性4龄幼虫(Lg),一且天牛羽化，Lm便进入到天牛的气管系统内，随羽化后的媒介天牛飞出。天牛携带L,飞出病树后，通过天牛在健康松树上补充营养时或在濒死和已经死亡的松树上产卵时所造成的伤口，松材线虫侵入松树体内，完成其侵染循环。松材线虫的侵染循环和形态学特征是该检疫操作规程的依据。5仪器、用具及药品光学显微镜、解剖镜、恒温箱、40目网筛、500日(或400目)网第、纱布、浅盘、漏斗、酒精灯、斧头、锯酒精、福尔马林(40%)、冰乙酸、甘油、三乙醇胺、蒸馏水、指甲油(无色)、乳酚油、封片蜡等。6现场检疫6.1查验单证检查报检时随附的单证并确认进境原木、木制品和木质包装材料的产地、品种，数量；验证来自美国、日本和韩国货物的无木包装声明或热处理证书是否与进境货物相符；根据货主或代理人提供的报检单证，对来自松材线虫疫区国家和地区的针叶木，木片等木制品实施松材线虫检疫。3对于来自于松材线虫疫区国家的进口针叶树原木，按每批总数比例的0.5%～5.0%随机抽查，但抽查的原木数不得少于20根。重点检查有无天牛危害症状。对于来自于松材线虫疫区国家的造纸用针叶树木片，分舱别，分层次按棋盘式选10点～50点扦取原始样品并制成复合样品。对于来自于松材线虫疫区国家的木制品和木质包装材料须全面检查其外表后，确定针叶木存在的位置，数量。用记号笔标记存在蓝变、具天牛虫孔、新伐木(具明显该材种气味或新鲜韧皮部)、含水量大或具树皮的可疑罹病木，并将其带同实验室检查。未发现上述可疑雅病木的，按每批总数比例的0.5%~5.0%随机拍样，但不得少于2件。6.3现场样品采集用手锯、斧头或其他工具，采集标记部位的样品，每采样点在采集时应至少采集到样品横截面中心部位。将采集的每个小样均分为两份，均分后的小样混合装在2个密封袋中，进行编号、记录，作为该批货物的混合待检测样品和留存样品。若有必要，也可将针叶树的可疑病木材直接带回实验室后再进行上述样品的采集。采集的样品临时存放在5℃~25℃环境中，如采集的样品较干燥(含水量14%以下),可在待检测样品的密封袋中放置一小块潮湿的纱布或吸水纸，以保证样品送检过程中松材线虫的存活率。待检测的样品应在12h内送到实验室进行线虫的分离，检测。6.4货物的后期监管现场采集样品后的货物，在未获得最终检测结果前，须接受严格的检疫监管。货物卸运地必须相对隔离和易于接受监管，其周边必须无松材线虫寄主树林，以防止病变木材的散失和昆虫的逃逸。7实验室检验7.1线虫分离线虫分离的具体方法参见附录A。若发现媒介天牛成虫，既要保护天牛的完整性以利天牛的种类鉴定，又要检查是否携带松材线虫，可以采取局部分离线虫的方法，即将天牛的触角端部或胸部腿节取下，捣碎后用漏斗法或浅盘法分离线虫，也可直接浸泡于加水的表面皿或小培养皿中，2h后在解剖镜下直接观察是否有线虫。7.2制片观察根据上述分离方法，如分离到线虫，将线虫置于解剖镜下，挑取或吸取线虫至含1滴水的载玻片上，使线虫沉底并位于水滴中央，于酒精灯火焰上过5g~6s致使线虫恰好被杀死为止，加盖盖玻片后，待将制好的玻片置于光学显微镜下观察。8松材线虫的形态特征8.1伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)的主要形态特征和测计值虫体细长(a值大于30),体长0.4mm～1.5mm。唇高，继握。口针有圆而小的基部球。排泄孔常位于中食道球后。雌虫阴门有角质膜阴唇或阴唇突；后阴子官囊长。尾有时园，尾端圆锥形或锐指状，末端有或无尾尖突。交合刺成对、窄，常有拉长的顶尖(apex)和显著的喙(rostrum),雄虫尾弓形，短指状，端生交合伞。生殖乳突数目可变。无引带。8.2松材线虫的主要鉴定特征雕雄成虫均呈蠕虫状，长1mm左右；口针基部微厚；中食道球几乎充满体腔，食道腺细长，约为虫体食道处体宽的3倍～4倍长，背部覆盖；排泄孔位于食道和肠的交接处，有时位于神经环水平处；半月8.3松材线虫的形态测计值松材线虫的形态测计值见表1。燃虫bcV推中山b9结果判定9.1结果初判断以雌、维成虫的形态特征为依据，符合上述形态特征可鉴定为松材线虫。目前，伞滑刃线虫属中有效种近50个，大多数种与昆虫尤其是甲虫和穿钻性害虫有关，常在针叶树木内出现，它们都是食真菌性的。同时，松材线虫和其他同属相近的种主要由墨天牛属的媒介天牛传播，故此线虫的鉴定中易出现错误。其中松材线虫与拟松材线虫(B.macrematus)形态最为相似，它们均出现在针叶树木材内，并且有交合刺远端膨大和阴门盖，两者的主要区别是雌虫尾部特征，松材线虫雌虫尾端宽圆，无尾尖突，或有尾尖突，但尾尖突长度不超过2μm(一般为1pm左右);而拟松材线虫尾端指状，有尾尖突，长度在3.5μm以上(常超过5pm)。在口岸的检疫中，有时只发现线虫的幼虫，可进行保温保湿培养或单异活体培养，获得成虫后再对线虫作进一步的鉴定(参见附录B)。9.2结果复核对第1次藏获松材线虫的结果，需经过专家复核。提供复核的材料为具松材线虫雌成虫，雄成虫的线虫分离液、临时玻片、照相或影像材料等。10检疫处理一旦发现截获松材线虫，须对进境的针叶树原木、木片、木制品和本质包装材料采取退货，销毁或检验检疫部门许可的检疫处理措施。11样品的保存保存样品经登记和经手人签字后妥善保存2个月。如发现松材线虫，该样品至少需保存6个月，以备复验、谈判和仲藏。保存期满后，含松材线虫的样品，必须经灭活处理，处理方法为销毁或热处理(木材的中心温度达到56℃时，处理30min以上)。(资料性附录)松材线虫分离方法A.1漏斗分离法其装置是将漏斗(直径10em~15cm)架在木架或铁架上，下面接10cm长的橡皮管一段，橡皮管末端安装一个止水夹。具体操作步骤如下：将劈好的细木片用双重纱布包好，放在盛满清水的漏斗中(由于线虫的趋水性和自身的质量，线虫离开植物组织，在水中游动，最后沉降到漏斗末端的橡皮管中)。12h~24h后打开弹赞夹，用表面皿或小培养皿接取约5mL水样直接镜检；或用离心管接取约5mL的水样，静置20min左右或1500r/min离心3min,倾去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液后，再进行镜检。A.2浅盘分离法浅盘分离法装置由两只不锈钢浅盘，线虫滤纸或宽幅卫生纸组成。一只浅盘口径小，可套放于另一只浅盘内，并且其底部用粗筛网(10目)取代，被称为筛盘；另一只是正常浅盘。将线虫滤纸(无专用线虫分离滤纸的可用擦镜纸或双层卫生纸代萃)平放在筛盘赔网上，用水淋湿，接着将劈好的细木片撒在其上；从两只浅盘的夹缝中注水，以淹没供分离的材料为止；在15℃~28℃下放置1d~3d后，将浅盘中的水连续通过500目的筛网，然后将500目标准筛上的含线虫的残留物冲洗到小培养皿中，供镜检。A.3其他分离方法用斧头将木材劈成薄的木片(厚度在0.5cm以下),浸泡于大盆或塑料桶中，于室温下浸泡1d~3d后移去木片，将盆或桶中的水连续通过40目和500目的筛网，然后将500目标准筛上的含线虫的残留物冲洗到小培养皿中，供镜检。该方法简单方便，可分离的样品数量大，得到的线虫量多。使用以上方法分离松材线虫时，室内温度应要保持在15℃~28℃之间；当室温过高或过低时(影响线虫的分离效果),须在恒温设施中进行松材线虫的分离。(资料性附录)松材线虫成虫的培养当分离得到的线虫数量较少或仅分离到形态和松材线虫形态相似的线虫幼虫时，可通过培养获得大量成虫，以便进一步鉴定。B.1病木保温保湿培养将样品锯成小段，置于烧杯中，加少量清水，使木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在25℃保温保湿培养放3d～4d,倒取杯中水液，可获得较多雌雄成虫。或将样品适量喷湿，散于塑料袋里扎紧，置于25℃恒温培养箱中3d~4d取出重新分离，可获得较多雌雄成虫。B.2单异活体培养通常用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)或多毛孢(Pestalotiasp.)培养松材线虫。制取马铃薯一葡萄糖一琼脂(PDA)培养基平板，挑取PDA斜面上的一小块灰葡萄孢，移在PDA平板上，放入25℃~28℃恒温箱培养，经4d～5d菌丝可铺满平板。将线虫集中在指形管中，加入线虫消毒液后加塞振荡1min。经过几分钟消毒处理后，线虫也沉降到指形管的底部，用移液管吸去上层药液，最后用灭菌水洗涤2次～3次。在长满灰葡萄孢的PDA平板上接种表面消毒了的线虫悬浮液0.5mL,在25℃~28℃恒温箱中培养平板，一般经过一周便可产生大量线虫，常用于松材线虫消毒的消毒液及处理时间见表B.1,也可将待消毒