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文档简介

进出口食品中大肠杆菌检验方法谷氨酸脱羧酶法5.2.2培养基和试剂培养基和试剂见附录A。5.3仪器设备5.3.1培养箱135℃±1℃。5.3.2高压灭菌锅:121℃±1℃。5.3.3离心机;500g(转速计算方法参见附录B)。5.3.5均质器;8000r/min。5.3.6冰箱:0℃~4℃;-18℃以下。5.3.8试管:20mm×200mm,15mm×150mm。5.3.9螺帽离心试管:10mL。5.3.10发酵管:根据不同样品选择不同型号。5.4样品制备与保存固体或半固体样品:无菌操作称取25g样品,放入装有225mL.磷酸缓冲液(PBS)韬释液的灭菌均质杯内,8000r/min均质1min~2min(也可用灭菌研体研磨代替),制成1110的样品匀液。干粉样品:无菌操作称取25.0g样品,放入装有225mLPBS稀释液和适量玻璃珠的500mL广口瓶(或三角瓶)中,以30cm探幅,7s探荡25次(也可机械振荡30s),制成1110的样品匀液。液体样品:用灭菌移液管吸取25mL样品《吸取样品时,移液管插入液而下不超过2.5cm,排出液体时不要将移液管插入稀释液中),放入盛有225mL.PBS稀释液的500ml.广口瓶(或三角瓶)中,按上述方法充分探荡,制成1:10的样品匀液。用1mL移液管准确吸取1:10的样品匀液1mL,放入装有9ml.磷酸缓冲液的试管中,按上述方法充分振荡,制成1:100的样品稀释液(操作时注意移液管不要与装有稀释液的容器接触)。按照上述同样的方法依次制成10倍系列稻释液(估计样品的污染程度并决定样品的最高稀释度,应保证接种后最高稀释度所有试管为阴性),整个操作过程不应超过15min。5.4.2样品保存若样品不能及时测定,冷冻样品应置于一18℃以下冰箱保存;非冷冻易腐食品置于0℃~4℃冰箱保存。测定前,冷冻样品可于0℃~4℃融化,时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的环境中融化,时间不超过15min。5.5测定步骤每个样品至少选择三个适当的连续稀释度,每个稀释度接种三管LST肉汤,每管接种1mL(必要时用双料LST肉汤接种10mL液体样品或10mL固体样品匀液)。分别接种一管大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和PBS稀释液作为阳性、阴性和空白对照。置于35℃±1℃培养20h±2h。取产气试管中的培养液5mL,转移到10ml螺帽锥形离心管中,置于离心机中500g离心10min,弃去上清液。用5mL磷酸盐缓冲液将沉淀物重新悬浮(机械振荡1min~2min或手摇振荡至沉淀溶解),500g重复离心一次,弃去上清液。在沉淀物中加入1.0mLGAD反应液,充分器药混合后置于35℃±1℃培养,4h内观察反应结果。5.6结果判定和报告5.6.1结果判定GAD反应液在4h内变为蓝色为判定为阳性反应,其他颜色均判定为阴性反应。5.6.2结果报告记录4h内的阳性管数,并对照记录结果查MPN表(见附录C),报告每克(或毫升)样品中大肠杆N=V500×10/1.118×9.0=V496919I=2230(r/min)使用三管法,接种量分别是0.1g(mL)、0,01g(mL),0,001g(mL).00000000111133002032336932002302802302303033333333333333333000120230230注:表内所列检样量如改用1g(mL),0.1g(mL)和0.001g(mL)时,表内数字应相应降低10倍,如改用(mL),0.001g(mL)和0,0001g(mL)时,则表内的数字应相应增加10倍6 7 8 8 8 9 9 9 9 9 InspectionofEscherichiaco9CorducttotherelatedsectionofStandardSNO33Intheacidanvironment,EscherichiacolipacidinGADreactlonliquidandproduceY-proEnterobacteriacoae),causethechangeofpHinmediuPositivereferenceculture;EschNegativereferenceculture:Kletsiell5.3.3centrifuges:500AnnexAA.1LaurylsulDissolvethecomponentsinthedistilledwater(byDoublethequantityofallcomponentsexceptDistilledwtilledwater(byheatingifnecessary),dispensetheThereagentshouldmixedthoroughlyuntillalltheingredientstobediDipotasslumhydrogenphosphateDistilledwaterDissolvingDipotassiumhydrogenphodrateto7.2,addsterilizedwaterto1000mL.StoreinTransfer1.25mLreservesolutionto1000mLvolumetricbottldistributeintosuitablevesB.1Calculationseeformula(B.1):N-revolvingspeed,theunitisr/min(revo—Rotorradius,lengthfromthecenterofrunnershafttothewallofthecentrifugaltRCF-RelativecentriB.2TherevolvingspeedseeforFarexample:Rotorradiusr=9.0cm,relativecantrifugN=√

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