【课件】动物细胞融合技术与单克隆抗体课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第二章动物细胞工程第2节动物细胞融合技术和单克隆抗体（第二课时）目录/CONTENTS01动物细胞融合技术02制备单克隆抗体03单克隆抗体的应用04习题检测学习目标：1.举例说出动物细胞融合的概念、原理及应用。2.阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程。3.认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。新课导入植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养植物体细胞杂交技术打破生殖隔离,实现远缘杂交育种，培育植物新品种。

提问：有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集中不同细胞优势于一身的动物细胞呢？新课导入实例：1970年，人—鼠细胞荧光标记融合实验人细胞鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白细胞融合人鼠杂交细胞37°培养40min细胞融合实验表明：细胞膜具有一定的流动性新课导入思考：动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？无需去除细胞壁；全能性受限制，不能培育成新的动物个体。显微镜下的动物细胞融合目录01一、动物细胞融合技术一、动物细胞融合技术1.动物细胞融合技术（1）概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜具有一定的流动性。（2）原理：（3）诱导细胞融合的三种方法：物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG）融合法生物法：灭活病毒诱导法——动物细胞融合特有灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，并不破坏病毒的抗原结构。（4）过程：细胞膜融合细胞核融合细胞质融合细胞融合的实质：一、动物细胞融合技术思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片原理是什么？灭活病毒诱导法一、动物细胞融合技术病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。灭活病毒诱导法原理用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程：病毒颗粒灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面，使细胞互相凝聚细胞膜融合细胞核融合形成杂交细胞细胞膜打开细胞质融合融合完成的标志一、动物细胞融合技术（5）结果：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。（6）意义：形成单核的杂交细胞。即融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。（7）应用：研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤细胞技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。一、动物细胞融合技术1、动物细胞完成融合实质及完成的标志是什么？【思考讨论】当两个细胞核融合后形成具有单核的杂交细胞，标志动物细胞融合完成。2、不灭活的病毒能否作为诱导剂？不能。用病毒作为诱导剂时，必须事先灭活，使病毒失去感染和增殖能力，但不破坏病毒的抗原结构。而不灭活的病毒会感染细胞，不能诱导细胞融合。一、动物细胞融合技术动物细胞融合与受精作用的区别注意说明（1）受精作用：是在同种生物之间进行的，精子与卵细胞的融合不需要任何诱导剂，受精卵内具备同种生物的两个亲本的遗传物质。（2）动物细胞融合可在不同物种间进行，由于物种间存在生殖隔离，所以自然条件下不能融合成杂交细胞，必须有诱导剂才能融合。形成的杂交细胞具备两个亲本细胞的遗传物质，从而体现两个亲本的遗传特性。受精作用动物细胞融合一、动物细胞融合技术植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志意义主要用途细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、离心法；高Ca2+-高pH融合法聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体习题检测1．与植物原生质体相比，动物细胞融合特有的诱因因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒（）2．灭活的含义是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是不破坏它们的抗原结（）二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞（）×√√习题检测1．下列关于动物细胞融合技术及意义的叙述，不正确的是(

)A．可以利用动物细胞融合技术生产细胞因子

B．动物细胞融合可打破生殖隔离获得新物种

C．细胞融合过程与细胞膜的结构特点直接相关

D．动物细胞融合为制备单克隆抗体开辟了新途径B习题检测2．下列对植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较，描述正确的是(

)A．动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导融合的方法也完全相同B．两者都可以跨越种属间的生殖隔离，突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能C．利用植物体细胞杂交技术而发展起来的杂交瘤技术，为生产单克隆抗体开辟了新途径D．目前科学家终于实现了两个植物物种间的体细胞杂交，得到了同时具有两个物种遗传物质的“超级植物”，并使它们的性状全部得以体现B二、制备单克隆抗体2021年，全国在抗击COVID-19疫情的时候，我们从新闻里看到很多康复者在捐献血浆，用来治疗其他病人。那么，血浆里到底是什么东西能够治疗新型冠状病毒感染？但是一个捐献者200~300ml的血浆，如果合格，也只能治疗2~3个患者。康复患者体内有大量的综合抗体对抗病毒如何解决？目录02二、制备单克隆抗体二、制备单克隆抗体早期获得抗体的方法传统抗体制备方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。抗原不能无限增殖产生大量抗体动物体内抗原

反复注射浆细胞抗体筛选单一B细胞增殖分化抗体不纯缺点：产量低，纯度低，制备的抗体特异性差。如何解决这个问题呢？二、制备单克隆抗体阅读P49并思考：科学家发现B淋巴细胞有什么特点？（１）动物体内产生的特异性抗体种类多达百万种；（２）每个B淋巴细胞（浆细胞）只分泌一种特异性的抗体。科学家发现：单一B淋巴细胞每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体

选择克隆细胞群大量纯度高、特异性强的抗体产生①大量制备单一抗体的思路：②存在的问题：B淋巴细胞不可能无限增殖（浆细胞高度分化）二、制备单克隆抗体什么细胞能无限增殖？癌细胞如骨髓瘤细胞（体外可以大量增殖，但是不能产生抗体）有什么方法将这两种细胞的特点结合起来？动物细胞融合技术③解决方案：一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体二、制备单克隆抗体制备单克隆抗体二、制备单克隆抗体注射特定的抗原体外培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合用特定的抗原免疫小鼠，从脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。多种杂交细胞*不是为了得到抗体如BB、B瘤、瘤瘤等2.单克隆抗体的制备过程二、制备单克隆抗体杂交瘤细胞（多种）置于选择性培养基上培养第一次筛选融合的细胞B细胞自身融合未融合的B淋巴细胞B瘤骨髓瘤细胞自身融合未融合的骨髓瘤细胞B瘤B瘤第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。第一次筛选二、制备单克隆抗体知识拓展：第一次筛选获得杂交瘤细胞。资料：已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能合成DNA，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长培养基中加入氨基喋呤（HAT选择培养基）B淋巴细胞合成DNAS途径D途径不能分裂增殖骨髓瘤细胞不能合成DNAD途径能无限增殖任务：请根据以上信息，设计一种方法，从培养基中筛选出杂交瘤细胞。杂交瘤细胞合成DNAS途径D途径不能分裂增殖二、制备单克隆抗体注射特定的抗原体外培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合用特定的抗原免疫小鼠，从脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。多种杂交细胞*不是为了得到抗体如BB、B瘤、瘤瘤等2.单克隆抗体的制备过程二、制备单克隆抗体筛选原因：由于小鼠体内提取的B淋巴细胞有很多种，形成的杂交瘤细胞也有很多种杂交瘤细胞(多种)能分泌所需抗体的杂交瘤细胞多孔培养板克隆化培养和抗体检测将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）第二次筛选阳性孔多孔细胞培养板抗体检测板(抗原-抗体杂交技术)二、制备单克隆抗体每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞多次96孔板培养和筛选克隆化培养抗体检测检测原理：抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）—抗原抗体杂交法。在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。第二次筛选二、制备单克隆抗体在体外培养培养液中获取从腹水中获取筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞单克隆抗体【培养杂交瘤细胞的方法比较】项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高相关技术和原理：动物细胞融合、动物细胞培养；细胞膜的流动性、细胞增殖（有丝分裂）二、制备单克隆抗体注射抗原用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞多种B淋巴细胞培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合诱导融合多种杂交细胞杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长多轮次的克隆化培养和抗体检测抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖体外培养注射到腹腔单克隆抗体从培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体二、制备单克隆抗体课堂小结多种B淋巴细胞B淋巴细胞注射特定抗原骨髓瘤细胞融合B-B细胞杂交瘤细胞瘤-瘤细胞多种杂交瘤细胞符合要求的杂交瘤细胞抗原—抗体杂交法

筛选2克隆化培养体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体B细胞瘤细胞选择培养基筛选12、诱导其融合的方法有哪些？1、注射特定抗原的目的是什么？获得能产生特定抗体的B淋巴细胞物理：电融合法化学：聚乙二醇（PEG）融合法生物：灭活病毒诱导法3、杂交瘤细胞的特点？既可以产生抗体，又可以大量增殖4、两次筛选的目的？第1次筛选：得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选：得到能分泌所需要抗体的杂交瘤细胞。二、制备单克隆抗体课堂小结多种B淋巴细胞B淋巴细胞注射特定抗原骨髓瘤细胞融合B-B细胞杂交瘤细胞瘤-瘤细胞多种杂交瘤细胞符合要求的杂交瘤细胞抗原—抗体杂交法

筛选2克隆化培养体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体B细胞瘤细胞选择培养基筛选15、单克隆抗体制备过程中应用到的细胞工程技术手段？动物细胞融合、动物细胞培养6、单克隆抗体制备过程原理？细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖（有丝分裂）7、单克隆抗体的优点？①能准确地识别抗原的细微差异。②与特定抗原发生特异性结合。③可以大量制备。（特异性强、灵敏度高、可大量制备）目录03三、单克隆抗体的应用三、单克隆抗体的应用①作为诊断试剂：(最广泛的用途)资料1:用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10天左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。女性怀孕后会分泌一种糖蛋白,-人绒毛膜促性腺激素(HCG)，尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。(抗原-抗体杂交法)三、单克隆抗体的应用①作为诊断试剂：(最广泛的用途)原理：准确识别各种抗原的细微差别，与抗原特异性结合，并可大量制备。优点：准确、高效、简易、快速同位素标记或荧光标记的单克隆抗体，在特定组织中成像，定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。三、单克隆抗体的应用资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤西包的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。②用于运载药物：(主要用于癌症的治疗)单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC三、单克隆抗体的应用②用于运载药物：(主要用于癌症的治疗)优点1、特异性强、灵敏度高，可以大量制备。优点2、位置准确、疗效高、毒副作用小：不损伤正常细胞，减少剂量★组成：

——单抗导向，药物为弹头生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物(放射性同位素/细胞毒素）单克隆抗体：导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置抗癌药物：杀死癌细胞三、单克隆抗体的应用1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？讨论：抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。三、单克隆抗体的应用2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？三、单克隆抗体的应用4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。

单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。曲妥珠单抗二、制备单克隆抗体项目第一次筛选第二次筛选（需要多次筛选）筛选原因筛选方法筛选结果诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞。用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。筛选获得杂交瘤细胞因为小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养基筛选获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌特定抗体的细胞获得能分泌特定抗体的杂交瘤细胞第一次筛选和第二次筛选本章小结概述应用动物细胞融合技术结果意义原理融合方法原理应用单克隆抗体的制备免疫处理第一次筛选诱导融合第二次筛选大规模培养诊断试剂运载药物治疗疾病克隆化培养抗体检测体外培养小鼠腹腔过程习题检测1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交细胞（）2.单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（）3.ADC的抗体具靶向运输作用，药物具有治疗作用（）××√习题检测概念检测（教材51页）1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（

）

A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性

B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合

C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞

D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株C习题检测概念检测（教材51页）2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）

A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒

B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体

C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞

D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A习题检测扩展应用3.假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。

可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，日前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。真题检测(2020全国卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是

。(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤:

。(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于

，使用该培养基进行细胞培养的结果是

。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是

。(4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有(答出2点即可)

。诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞将小鼠的脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液选择培养基抗原与抗体的特异性结合只有杂交瘤细胞能够生存将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养真题检测（2023·北京·高考真题）1.甲状旁腺激素（PTH）水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，有关制备过程的叙述不正确的是（）A．需要使用动物细胞培养技术B．需要制备用PTH免疫的小鼠C．利用抗原-抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞D．筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞D真题检测（2022·山东·高考真题）2.如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是（）A．双抗可同时与2种抗原结合B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D．同时注射2种抗原可刺