基因诊疗医学宣教专家讲座VIP

第19章基因诊疗GeneDiagnosis基因诊疗医学宣教专家讲座第1页人类疾病原因内因：基因结构改变（基因突变）——点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增

基因结构多态性

基因表示异常外因：

病原体侵入基因诊疗医学宣教专家讲座第2页对于疾病诊疗依据：临床表现试验室诊疗技术：

细胞学检验生物化学代谢产物和酶活性改变检验免疫学检验

基因诊疗基因诊疗医学宣教专家讲座第3页细胞核DNA转录翻译mRNA蛋白质细胞膜血清学诊疗基因诊断生化学诊疗临床学诊疗临

床表现基因诊疗医学宣教专家讲座第4页一、基因诊疗概述(一)基因诊疗概念与特点(二)基因诊疗基本原理与临床意义基因诊疗医学宣教专家讲座第5页(一)基因诊疗概念与特点1．概念：

指利用分子生物学技术，从DNA或RNA水平检测基因存在、分析基因结构变异和表示状态，对疾病作出诊疗方法和过程。基因诊疗以DNA和RNA为诊疗材料，

DNA诊疗RNA诊疗基因诊疗医学宣教专家讲座第6页2．基因诊疗特点：（1）直接检测基因，属病因诊疗，针对性强；（2）特异性强、灵敏度高：因为基因诊疗采取核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术；（3）适用范围广：其应用范围已从原先局限遗传性疾病扩大到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域。基因诊疗医学宣教专家讲座第7页(二)基因诊疗基本原理与临床意义1．基本原理：

经过检测致病基因（包含内源基因与外源基因）存在、量多少，结构改变是否及表示水平是否正常，以确定被检验者是否存在基因水平异常改变，以此作为疾病确诊依据。2．临床意义:

对有表型出现疾病作出明确诊疗

早期快速诊疗

确定个体对疾病易感性疾病分期分型、疗效监测、预后判断等

基因诊疗医学宣教专家讲座第8页二、基因诊疗惯用技术与方法(一)基因诊疗惯用技术(二)基因诊疗基本方法基因诊疗医学宣教专家讲座第9页(一)基因诊疗惯用技术1.核酸分子杂交2.PCR（聚合酶链式反应）3.限制性酶切分析4.SSCP（单链构象多态性分析）5.DNA测序6.DNA芯片技术基因诊疗医学宣教专家讲座第10页1.核酸分子杂交

Southernblot——DNANorthernblot——RNADotblotInSituHybridization,

基因诊疗医学宣教专家讲座第11页核酸分子杂交流程示意图待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参加杂交探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标识核酸探针基因诊疗医学宣教专家讲座第12页探针种类DNA

探针:基因组DNA探针;基因探针cDNA探针:当前应用最广泛寡核苷酸探针(Oligonucleotideprobes)RNA

探针:基因诊疗医学宣教专家讲座第13页

不一样探针在应用中有各自特点,但最主要是探针序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择。

对致病性微生物应选取其最保守、最特异序列；对突变基因检测，应用含有突变位点序列或待测基因编码ｍＲＮＡ序列。基因诊疗医学宣教专家讲座第14页探针标识物放射性标识物32P，35S，125I，3H非放射性标识物生物素，地高辛，荧光素，酶，金属基因诊疗医学宣教专家讲座第15页SouthernblotNNTTNTT基因诊疗医学宣教专家讲座第16页1、Southernblot：用于DNA检测，不但能检测出特异DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。2、Northernblot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。3、dotblot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组中特定基因及其表示定性和定量分析。缺点：特异性较低，不能判定所分析基因分子量。4、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位。基因诊疗医学宣教专家讲座第17页PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化反应重复进行同一段DNA片段合成过程（二）PCR技术是基因诊疗一个基础技术基因诊疗医学宣教专家讲座第18页PCR技术优点特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率基因扩增技术基因诊疗医学宣教专家讲座第19页聚合酶链反应（PCR）PCR多重PCR：多对PCR引物同时进行PCRPCR/SSCPPCR/ASO基因诊疗医学宣教专家讲座第20页1、直接采取PCR技术进行基因诊疗

经过PCR技术扩增特异性基因，能够确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关体内基因缺失或基因突变

基因诊疗医学宣教专家讲座第21页2、采取PCR产物限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）

PCR－RFLP就是利用PCR技术先将包含待测位点DNA片段扩增出来，然后用识别该位点限制性内切酶水解，依据限制性片段数量和长度作出诊疗。基因诊疗医学宣教专家讲座第22页3、采取PCR-ASO技术等位基因特异性寡核苷酸探针技术（ASO）原理：针对已知突变位点基因，能够分别针对已知突变位点序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针中央，这么在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全互补探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基与靶序列不匹配探针则被洗脱。基因诊疗医学宣教专家讲座第23页

已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标识，进行斑点杂交。

NormalβΑGeneProbe——与正常

ProbeβΑ杂交稳定

MutationβSGeneProbe——与异常

βS杂交稳定

PCR-ASO技术基因诊疗医学宣教专家讲座第24页等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide）基因诊疗医学宣教专家讲座第25页斑点杂交结果：

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

突变型遗传病直接基因诊疗正常探针突变探针基因诊疗医学宣教专家讲座第26页4、PCR产物反相点杂交分析技术

此项技术与PCR/ASO技术原理完全相同，只是杂交时采取是反相杂交。是将探针固定在膜上成为固定相，用PCR产物作为液体相，进行杂交试验。基因诊疗医学宣教专家讲座第27页

单链构象多态性（SSCP）分析是一个基于单链DNA构象差异来检测点突变方法。DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间相互作用，形成一定立体构象。相同长度单链DNA会因分子内碱基组成或排列次序不一样，形成构象就不一样，这么就形成了单链构象多态性。对长度相同而构象不一样单链DNA在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不一样迁移率。

5、采取PCR产物单链构象多态性分析进行基因诊疗

(PCR-SSCP)基因诊疗医学宣教专家讲座第28页

PCR-SSCP技术就是利用PCR扩增目标基因片段，经过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸改变会造成DNA片段构象改变，其迁移率也会改变，从而检测基因突变。基因诊疗医学宣教专家讲座第29页基因诊疗医学宣教专家讲座第30页

该技术是先制备浓度从低到高变性剂凝胶，然后将待测分析PCR扩增产物进行电泳，到DNA电泳到变性剂浓度能使DNA发生变性位置时，DNA双链分开，因为不一样DNA片段碱基组成不一样，所以在凝胶中泳动发生变性位置不一样，迁移率也不一样，所以能够将相同长度但碱基组成不一样DNA片段分开，从而能检测出基因突变。6、采取PCR结合变性梯度凝胶电泳技术基因诊疗医学宣教专家讲座第31页

DNA甲基化是表观遗传学主要组成部分，在维持正常细胞功效、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着主要作用，是当前新研究热点之一。如在普通正常细胞中，基因调控区CPG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往展现甲基化状态。所以DNA甲基化研究是一热点。7、甲基化特异性PCR技术基因诊疗医学宣教专家讲座第32页

将DNA先用亚硫酸盐处理，这么未甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化不变，随即行引物特异性PCR。在MS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异性引物（primerⅠ），一对为非甲基化引物（primerⅡ），进行特异性扩增，只有结合完全甲基化或非甲基化特异性引物片段才能扩增出产物，最终能够确定研究DNA片段部位甲基化情况。甲基化特异性PCR技术（MS-PCR）基因诊疗医学宣教专家讲座第33页基因诊疗医学宣教专家讲座第34页以上介绍基于PCR扩增技术建立基因诊疗技术，只能提供定性结果，即有没有突变。但对基因表示异常疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基因表示量上改变分析，故还可利用PCR定量分析基因表示。PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀释法、极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法、

荧光定量PCR8、采取PCR技术进行靶核酸定量分析基因诊疗医学宣教专家讲座第35页PCR扩增有限性-平台期及平台效应（plateaueffect）PCR扩增平台效应基因诊疗医学宣教专家讲座第36页梯度（系列）稀释法：在扩增检测待测样本同时，扩增一系列稀释已知标准（通常为质粒DNA）假如在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增待测样本中PCR模板相对量

必须在扩增指数期进行

优点：简单，可作粗糙定量分析。缺点：不准确，影响原因多。

基因诊疗医学宣教专家讲座第37页首先将原始模板进行梯度稀释;然后对该稀释系列进行PCR扩增测定;最低阳性样本被认为含有与一已知标准稀释系列中最终阳性样本中相同量PCR模板基本依据：PCR扩增有效起始模板分子数为104～106个改良方法：极限稀释分析基因诊疗医学宣教专家讲座第38页基因诊疗医学宣教专家讲座第39页非竞争性对照基因定量法

该定量法是靶基因与参考基因同时扩增。即在一样反应条件下，在一个试管内同时扩增来自同一DNA一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们mRNA)。经过比较两种序列扩增产物电泳带颜色强度对靶基因定量。基因诊疗医学宣教专家讲座第40页靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参考标准通常是一段人工合成模板而不是内源性基因。竞争PCR必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，含有相同引物结合位点，其扩增产物能经过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量样品DNA进行PCR，经过分离和分析竞争模板与样品DNA产量，对样品DNA进行定量分析。竞争性PCR：基因诊疗医学宣教专家讲座第41页3.DNA

sequencing

DNA序列测定是最直接、最准确基因诊疗技术基因诊疗医学宣教专家讲座第42页例：四色荧光自动测序分析结果基因诊疗医学宣教专家讲座第43页基因诊疗医学宣教专家讲座第44页4.DNA芯片技术

DNAchipsormicroarray基因诊疗医学宣教专家讲座第45页

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印方式有序地固化于支持物表面，然后与标识样品杂交，经过对杂交检测分析，得出样品遗传信息（基因序列及表示信息）

因为在制备过程中利用了计算机芯片制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且惯用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术DNA芯片技术概念基因诊疗医学宣教专家讲座第46页DNA芯片技术原理大规模集成固相杂交基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性原理

以大量已知序列寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后经过定性、定量分析得出待测样品基因序列及表示信息基因诊疗医学宣教专家讲座第47页生物战剂检测临床疾病基因诊疗法医学判定药品研究开发动植物检疫基因组研究后基因组计划生物信息学DNA芯片DNA芯片技术应用领域基因诊疗医学宣教专家讲座第48页第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略

人类疾病各种多样，致病原因不一样，所以在基因诊疗上也有不一样路径和策略。

1、对致病基因已经找到、发生机制清楚疾病，能够经过直接检测致病基因进行基因诊疗。如：病原微生物感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病相关机体内源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。

基因诊疗医学宣教专家讲座第49页2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组特定区域疾病，能够经过检测致病基因联锁遗传标识进行基因诊疗。3、对多原因、多基因疾病，能够经过检测表型克隆基因进行基因诊疗。4、对一些因基因表示异常出现疾病，可经过基因表示定量分析进行基因诊疗。对与基因表示异常出现疾病，能够在转录水平上对该基因表示mRNA量进行分析，作出诊疗。

基因诊疗医学宣教专家讲座第50页第三节基因诊疗应用前景1.杂交基础上RFLP分析（20世纪80年代）2.PCR及其衍生技术3.基因芯片技术基因诊疗发展历史基因诊疗医学宣教专家讲座第51页第三节基因诊疗应用前景1.理论