(90)-第十一章 分子生物学实验技术 -第1.2.3节

第十一章分子生物学实验技术

TechniquesofMolecularBiology

111.1

基因组DNA的抽提与检测ExtractionanddetectionofgenomicDNA11.2总RNA的抽提与检测ExtractionanddetectionoftotalRNA11.3聚合酶链式反应（PCR）Polymerasechainreaction11.4DNA重组技术DNARecombinanttechnology311.5重组质粒DNA的提取与酶切鉴定ExtractionandenzymaticidentificationofrecombinantplasmidDNA11.6外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和鉴定InducedexpressionandidentificationofexogenousgenesinE.coli11.1

基因组DNA的抽提与检测ExtractionanddetectionofgenomicDNA一、基本原理和应用真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内的，因此制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类分离，又要保持DNA分子的完整性制备基因组DNA是开展基因结构和功能研究的基础5DNA抽提方法酚抽提法CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法异硫氰酸胍法Chelex-100法……6二、主要仪器7三、主要试剂及其作用8试剂作用原理功能SDS(十二烷基磺酸钠)破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性释放DNA

(fromnucleusandproteins)蛋白酶K降解细胞膜及核小体中的蛋白RNase消化RNA去除组织中的RNAEDTA螯合DNase所需辅助因子的Ca2+保持DNA分子的完整酚/氯仿/异戊醇使蛋白质变性去除蛋白质乙醇沉淀DNA使DNA从溶液中析出三、实验步骤（以动物组织为例）制备组织匀浆细胞裂解与蛋白消化酚抽提沉淀DNA洗脱、干燥溶解9核酸电泳检测样品制备提取DNA检测微量分光光度计测定DNA浓度四、DNA的检测

定性检测：核酸电泳检测10四、DNA的检测定量检测：微量核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度11Q1.核酸电泳检测不到DNAA：1）实验材料不新鲜，导致DNA降解2）试剂失效3）DNA沉淀洗脱等步骤操作不当4）核酸染料未添加Q2.核酸电泳条带弥散A：1）实验材料不新鲜，导致DNA降解2）实验操作动作较大，DNA断裂

3）电泳时电压不稳12五、常见问题及注意事项Q3.OD260/OD280

比值＜1.8A：提取的过程中发生蛋白质污染Q4.

OD260/OD280

比值>2.0A：提取的过程中发生有机溶剂污染13五、常见问题及注意事项倾斜吸取DNA溶液1411.2总RNA的抽提与检测ExtractionanddetectionoftotalRNA15一、RNA提取方法及原理

异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）胍盐/β-巯基乙醇法以及一些其他方法一、提取方法及原理异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）Trizol是一种总RNA抽提试剂，能够直接从细胞或组织中提取总RNA。Trizol内含异硫氰酸胍(

Guanidinethiocyante)等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，使RNA与蛋白质分离，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后RNA保留在水相中，DNA和蛋白质则在有机相中，转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，得到纯化的总RNA。提取RNA是进行基因表达分析的基础二、主要试剂17试剂作用原理功能Trizol使蛋白质变性，裂解细胞释放细胞中的核酸物质氯仿抽提酸性苯酚分离有机相和无机相异丙醇通过-OH的疏水作用使得RNA链中的亲水基团受到保护沉淀RNA75%乙醇去除盐分DEPCH2O（diethylpyrocarbonate），焦碳酸二乙酯处理的一级水通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性抑制RNA酶的活性三、实验步骤（以动物组织为例）18组织匀浆化分离阶段RNA的沉淀RNA的漂洗RNA的溶解电泳分析总RNAOD值分析总RNA19检测OD值电泳高质量RNA定义:浓度，纯度完整度四、实验结果分析四、实验结果分析浓度测定样品在260nm和280nm处的光吸收值，确定RNA的浓度纯度OD260/OD280在1.8~2.0视为抽提的RNA纯度很高OD260/OD280小于1.8，说明有蛋白或者苯酚污染OD260/OD280大于2.0，可能被异硫氰酸胍污染20四、实验结果分析RNA电泳普通琼脂糖凝胶电泳：可分开不同的RNA条带，能快速检测所提RNA的完整度，但是无法判定其分子量变性琼脂糖凝胶电泳:可判定RNA的完整度，也能测定RNA的分子量21五、注意事项及有效措施RNA易降解、RNA酶稳定，并广泛存在1）、严格戴好口罩，手套

2）、实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。

3）、实验所涉及的试剂/溶液，必须确保RNase-Free4）、实验全过程在低温环境下操作

222311.3聚合酶链式反应（PCR）Polymerasechainreaction24

1985年KaryMullis创立了PCR技术1987年完成了自动化操作装置1993年获得诺贝尔化学奖

一、PCR技术的来源聚合酶链式反应（PCR）是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTPs为底物，按照半保留复制原理，通过变性、退火、延伸三个步骤不断重复完成新DNA合成。25二、PCR技术的原理26科学研究Scientificresearch疾病诊断Diseasediagnosis人类基因组工程HumanGenomeProject法医Forensic肿瘤Thetumor检疫Quarantine其他……

other...27三、PCR技术的应用四、PCR反应系统DNA模板DNATemplate引物primer脱氧核糖核苷三磷酸

deoxy-ribonucleosidetriphosphateTaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase缓冲液buffer28DNA模板DNATemplate单、双链DNA模板RNA模板，需先逆转录成cDNA质粒模板高分子量的DNA（如基因组DNA）模板DNA模板的用量，应用ng级的DNA样本29引物primer两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段决定PCR扩增片段长度、位置和结果30碱基互补配对原则引物的最佳长度为20～24个核苷酸两个引物之间不应发生互补，避免产生“引物二聚体”两条引物的(G+C）%含量组成应均匀引物内部应避免形成明显的次级结构31引物设计要点是指引物和模板结合时候的温度参数引物的退火温度决定PCR特异性与产量合理的退火温度从55℃到70℃32引物退火温度Ta=Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃A，T，G，C分别表示相应碱基的个数引物设计常用软件33单机版软件：PrimerPremier系列、Oligo系列、Omiga、DNastar在线软件：Primer-Blast、Primer3脱氧核糖核苷三磷酸

deoxy-ribonucleosidetriphosphatedNTP的质量与浓度和PCR扩增效率密切相关常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM四种dNTP的浓度应相同34TaqDNA聚合酶

TaqDNApolymerase最早来自于嗜热水生菌催化PCR反应常用的分为rTaq酶和LTaq酶两类35PCR缓冲液PCRbuffer10～50mM的Tris–HCl缓冲液（pH8.3）+1.5mMMgCl二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低Mg2+其浓度变化范围为1～10mmol/L36PCR循环次数37一般为25～40个循环循环次数过多，非特异性背景严重循环次数太少，产率偏低38五、PCR反应体系及步骤PCRMixtur：TemplateDNA1

l(10ng)Primer11

l(10M)Primer21

l(10M)dNTPs2

l(10mMeach)TaqDNApolymerase0.5

l(5U/l)10×buffer2.5

lddH2O17

lTotal25

l将PCR反应