生物技术基因工程篇

关于生物技术基因工程篇基因工程(geneticengineering)基因工程又称DNA重组技术，即在体外把两种或者两种以上不同来源的DNA分子重新组合成新的DNA分子，通过载体转入受体细胞内，将所需要的经过修饰的基因在受体细胞内表达，产生人类所需要的基因或产物，或转基因生物。第2页,共62页，2024年2月25日，星期天基因工程的基本步骤分离/制备目的基因选择载体使目标基因与载体DNA连接形成重组体以重组体转化宿主细胞（细菌或其他细胞）筛选出能够表达重组DNA的宿主细胞，使这些细胞扩增、繁殖获得大量拷贝的目的基因使目的基因在宿主细胞表达出编码的多肽第3页,共62页，2024年2月25日，星期天基因工程（原核表达系统）操作的基本步骤第4页,共62页，2024年2月25日，星期天一、目标基因的制备1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）2、酶促合成法/反向转录法3、人工合成法4、通过PCR把目的基因扩增出来第5页,共62页，2024年2月25日，星期天1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）第6页,共62页，2024年2月25日，星期天优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用范围

基因组文库（genomiclibrary）的制备：用限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。缺点：所获得的DNA含有内含子，不能在原核细胞中表达。第7页,共62页，2024年2月25日，星期天2、酶促合成法/反向转录法

mRNA→逆转录→cDNA第8页,共62页，2024年2月25日，星期天3、人工合成法蛋白质的氨基酸序列※用于结构清楚、分子量较小的基因核苷酸序列化学合成目的基因按密码子推算第9页,共62页，2024年2月25日，星期天

利用化学合成法已成功合成人生长激素释放因子、胸腺素、血管升压素、胰岛素、α干扰素等基因，并进一步生产出相应的药物。第10页,共62页，2024年2月25日，星期天4、通过PCR把目的基因扩增出来第11页,共62页，2024年2月25日，星期天第12页,共62页，2024年2月25日，星期天二、载体的选择

载体（vector）：运载外源性DNA有效地进入到受体细胞内的工具。

载体应具备的条件分子相对较小（3~10kb）,能进行复制，且具有高拷贝数;具有几个单一的酶切位点，酶切位点应在复制子以外适当的位置;能接纳尽可能大的外源性DNA。外源性DNA插入后，载体在受体细胞中的复制不受影响。第13页,共62页，2024年2月25日，星期天④必须有便于筛选的明显标志，如耐药性和空斑形成等,以便于阳性克隆细胞容易被选出；有促进外源性DNA表达的调控区；对受体细胞无害。

※天然载体有很多缺点，远远达不到理想载体的要求，通常使用的载体都是经过改造过的载体。第14页,共62页，2024年2月25日，星期天质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒(vector)

载体的种类按来源分

克隆载体(cloningvector)按作用分表达载体(expressionvector)第15页,共62页，2024年2月25日，星期天1、质粒载体质粒的存在与否一般对细菌的生存没有决定性的影响。带有选择性遗传标志，如基因的产物可能是降解某些抗生素的酶。在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核细胞或真核细胞均可复制的穿梭质粒（shuttleplasmid）。在基因工程中应用广泛

。实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322,pUC19等。第16页,共62页，2024年2月25日，星期天质粒在宿主细胞中的复制有两种类型严密型质粒：复制需要蛋白质合成和DNA聚合酶Ⅲ的存在，它的复制与宿主细胞的增殖密切相关，每个宿主细胞内只有1~5个严密型质粒。

松弛型质粒：复制需要DNA聚合酶Ⅰ，可以在没有蛋白质合成的情况下继续复制，每个宿主细胞内可存有10~200个以上的松弛型质粒，在细胞蛋白质合成及染色质复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。

利用此原理可在质粒扩增时，加入氯霉素抑制宿主菌蛋白质合成，达到进一步扩增松弛型质粒的目的。第17页,共62页，2024年2月25日，星期天PBR322抗氨苄青基因抗四环素基因第18页,共62页，2024年2月25日，星期天质粒的构建第19页,共62页，2024年2月25日，星期天质粒携带外源基因第20页,共62页，2024年2月25日，星期天第21页,共62页，2024年2月25日，星期天（1）λ噬菌体2、噬菌体载体感染细菌的病毒特点：双链DNA分子（线性或环形）两端具有12个nt单链互补粘性末端COS位点具非必需区（中间区约1/3长度）可在体外包装成病毒颗粒，可高效感染宿主细胞（大肠杆菌）容量大，可以插入23～25Kb左右的外源基因。第22页,共62页，2024年2月25日，星期天第23页,共62页，2024年2月25日，星期天根据生活周期分

溶菌性：在细菌中连续增殖直到细菌裂解，释放噬菌体溶源性：将其DNA整合入细菌基因组DNA中，与宿主DNA一起复制，然后传给子代，宿主细胞不发生裂解。**只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。第24页,共62页，2024年2月25日，星期天噬菌体的溶源周期和溶菌周期第25页,共62页，2024年2月25日，星期天类型：

插入型载体：只有一个限制性内切酶位点可供插入外源性DNA片段。替代型载体：含有某个限制性内切酶的两个切点，这两个切点间的片段可以被外源性DNA替代。第26页,共62页，2024年2月25日，星期天第27页,共62页，2024年2月25日，星期天蓝白筛选载体中含一个LacZ基因

β-半乳糖苷酶

X-gal(无色)X(蓝色)+gal(半乳糖)其中X为显色底物：5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D半乳糖苷

在含X-gal和Lac操纵子诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的培养基中

◆非重组的噬菌体转化的宿主菌可以合成β-半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落形成蓝色噬菌斑。

◆重组的的噬菌体因LacZ基因被外源DNA插入而破坏，故其转化的宿主菌不能产生β-半乳糖苷酶，因而菌落形成无色噬菌斑。编码第28页,共62页，2024年2月25日，星期天第29页,共62页，2024年2月25日，星期天第30页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）M13噬菌体（M13phage）特点：单链线性DNA分子大肠杆菌被感染后，并不死亡，只是生长缓慢，而新的噬菌体被释放到菌体外。感染大肠杆菌后，单链线性DNA分子可转变成双链复制型(RF)。从大肠杆菌中分离出双链复制型的M13还可作为克隆双链DNA的载体具非必需区(IS)第31页,共62页，2024年2月25日，星期天从宿主菌体中释放出来的M13噬菌体粒子只含单链DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中两条中的一条，因此可用来制备单链DNA探针，也可以用作DNA测序的模板。筛选：蓝白筛选第32页,共62页，2024年2月25日，星期天

是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。

由入噬菌体的cos区与质粒重组建造而成。

在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。（3）粘尾质粒(cosmid)/粘性质粒/粘粒/cos质粒第33页,共62页，2024年2月25日，星期天cosmid的构造特点:

含有抗药标志和复制起始部位；

一个或多个单一酶的限制位点；

带有入噬菌体粘性末端；

分子小，可容纳大的外源DNA片段。第34页,共62页，2024年2月25日，星期天将染色体端粒序列（TEL）、自主复制序列（ARS）、着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP）基因和多克隆位点（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，转化酵母细胞YAC。（1）酵母为宿主的载体3、真核细胞为宿主的克隆载体人工构建的酵母质粒

酵母人工微小染色体（YAC）第35页,共62页，2024年2月25日，星期天第36页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）以植物细胞为宿主的基因克隆载体Ti质粒第37页,共62页，2024年2月25日，星期天（3）DNA病毒载体1）SV40载体（猴肾病毒）完整的SV40载体利用SV40元件组建的穿梭质粒载体，如pSVK3质粒：由噬菌体三种载体构建而成质粒SV402）乳头瘤病毒载体

如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。3）腺病毒载体

如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。第38页,共62页，2024年2月25日，星期天

克隆载体(cloningvector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。

表达载体(expressionvector)在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。第39页,共62页，2024年2月25日，星期天启动子、核糖体结合位点、克隆位点、转录终止信号大肠杆菌表达载体除克隆载体的特性外还含有：哺乳动物表达载体除含有原核序列（在E-Coli中的复制起始点、便于筛选的抗性基因）还包括：启动子/增强子、克隆位点、终止信号和加poly（A）信号。第40页,共62页，2024年2月25日，星期天三、目标基因与载体DNA连接形成重组体

工具酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

能识别DNA分子内部的特异的对称序列,水解磷酸酯键，切断分子。

识别序列的特点

①专一；②常由4~6个碱基组成；③具有回文序列BamH1酶-GGATCC-

-CCTAGG-第41页,共62页，2024年2月25日，星期天

限制性内切酶都是从原核生物中发现的。到目前为止已发现上千种限制性内切酶，其中数十种被经常使用。

水解磷酸二酯键，产生DNA片段的5′端为P，3′端为—OH第42页,共62页，2024年2月25日，星期天第43页,共62页，2024年2月25日，星期天限制酶的命名

EcoRⅠ细菌的属名从该细菌中分离出的第几个酶细菌种名细菌株系第44页,共62页，2024年2月25日，星期天切口类型：

（1）形成粘末端(cohesiveend)：第45页,共62页，2024年2月25日，星期天目的基因第46页,共62页，2024年2月25日，星期天第47页,共62页，2024年2月25日，星期天

连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。第48页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）形成平末端SmaⅠCCC↓GGG

GGG↑CCC第49页,共62页，2024年2月25日，星期天DNA连接酶(DNAligase)第50页,共62页，2024年2月25日，星期天四、重组DNA导入受体细胞转化（transformation）

以质粒为载体，将携带外源基因进入受体细胞的过程。转染（transfection）由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程。第51页,共62页，2024年2月25日，星期天受体细胞

大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞※受体细胞必须是限制性内切酶缺陷型，即R-菌株，使载体或重组DNA不被水解第52页,共62页，2024年2月25日，星期天受体细胞

大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞

细菌细胞作为表达系统

优点：操作简单、增代时间短、价格低廉；

某些蛋白质的表达水平很高

缺点:表达多肽分子常不能适当地折叠,蛋白质常无生物活性；

异体蛋白质，常对细菌有毒性作用；

缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如使蛋白质磷酸化、糖基化

第53页,共62页，2024年2月25日，星期天转化的方法（1）化学转化法Cacl2致敏转化法宿主：大肠杆菌感受态细胞（CompetentCell）：E-coli经Cacl2处理（0-5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。第54页,共62页，2024年2月25日，星期天转化程序：

感受态细胞+质粒DNA42℃、90sec不含抗生素的培养基热休克37℃涂布选择性平板37℃得到细胞的克隆

30-60min（合适抗生素）10hr（使