细胞工程产酶

关于细胞工程产酶细胞结构第2页,共44页，2024年2月25日，星期天微生物、植物、动物细胞特性比较细胞种类微生物细胞植物细胞动物细胞细胞大小（μm）1～1020～30010～100倍增时间（h）0.3～0.6>12>15培养要求简单简单复杂光照要求不要求大多数要求不要求对剪切力大多数不敏感敏感敏感主要产物酒精、酒类、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等色素、药物、香精、酶等次级代谢产物疫苗、激素、单克隆抗体、酶等功能蛋白质第3页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学4一、植物细胞特点体积大生长和代谢速率低营养要求简单要求光照对剪切力敏感生产色素、药物、香精和酶等次生代谢产物第4页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学5二、植物细胞培养的特点产率高周期短易于培养，减轻劳动强度产品质量高第5页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学6三、植物细胞培养的工艺流程植物细胞培养技术首先从植物外植体中选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得优良的植物细胞。然后，在人工控制条件的植物细胞反应器中进行植物细胞培养，从而获得代谢产物。植物细胞培养的一般工艺过程如下

: 细胞株建立——扩大培养——大罐培养第6页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学7（一）外植体的选择和处理外植体是指从植株分离出，经过预处理后，用于植物组织和细胞培养的植物组织的小段或小块。外植体首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植株，如果植物细胞是用于生产次级代谢物，则需从产生该次级代谢物的组织部位中切取一部分组织，经过清洗，除去表面的污物。将上述外植体切成

0.5～1cm左右的片段或小块，用

70%～75%乙醇溶液或

5%次氯酸钠、10%漂自粉、0.1%升汞溶液等进行消毒处理，再用无菌水充分漂洗，以除去残留的消毒剂。第7页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学8（二）植物细胞的获取植物细胞可以通过机械捣碎或酶解的方法直接从外植体中分离得到，也可以通过诱导愈伤组织而获得，还可以通过分离原生质体后再经过细胞壁再生而获取所需的植物细胞。通常采用愈伤组织诱导方法获得所需的植物细胞。第8页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学91.直接分离法植物细胞可以直接从外植体中分离得到。从外植体直接分离植物细胞的方法通常有机械法和酶解法两种。机械捣碎法分离植物细胞是先将叶片等外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。酶解法分离细胞是用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离出具有代谢活性的细胞。第9页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学102.愈伤组织的诱导法

愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的基本过程如下：将含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基中加入

0.7%～0.8%的琼脂，制成半固体的愈伤组织诱导培养基。灭菌、冷却后，将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，即从外植体的切口部位长出小细胞团，此细胞团称之为愈伤组织。一般培养

l～3周后，将愈伤组织分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养，以获取更多的愈伤组织。第10页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学113.原生质体再生法

原生质使是除去细胞壁后得到的微球体。植物原生质体可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、器官中获得。植物原生质体的分离方法一般有机械分离法和酶解法两种，目前一般都采用酶解法分离原生质体。第11页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学12（三）植物细胞培养1.高产细胞系的选择2.植物细胞培养的培养基3.提高植物细胞产酶量的方法第12页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学131.高产细胞系的选择提高产率是植物细胞发酵生产次生物质的主要目的。因此，选择高产细胞株是培养和生产的前提。目前选择高产细胞株的途径主要有以下几个方面：（1）材料选择（2）克隆选择（3）抗性选择（4）诱导选择（5）细胞融合和基因工程选择第13页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学14（1）材料选择一般来说，从具有高含量次生物质酶的植物组织建立起来的细胞培养物能得到较高的产量，但也有不少相反结果的报道。Berlin和Sasse(1985)提出最好从不同遗传来源的材料建立细胞培养物，然后再从中选择。第14页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学15（2）克隆选择在培养过程中，可能大部分的细胞由于生长迅速，酶积累较少，但也有少量的细胞可以积累较多的酶。因此，可以通过单细胞克隆或细胞团克隆技术将这些可以积累较多酶的细胞挑选出来培养成细胞系。这种选择方法己在提高细胞系物质含量的研究中得到广泛的应用。第15页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学16（3）抗性选择选择压力筛选法是通过添加某些对不同的细胞有不同作用效果的物质，淘汰部分敏感细胞，而选择得到所需的细胞的选育方法。可以分为正选择和负选择两种。正选择就是把受选择的细胞群体置于一定的选择压力之下，部分细胞在选择压力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞可以生长，从而选择得到所需的细胞。正选择适用于对抗性突变体的选择。负选择法也叫富集选择法。在负选择实验中，选择的对象是在一定选择压的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。负选择适用于对营养缺陷型突变体的选择。第16页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学17（4）诱导选择通过化学或物理诱变可以明显提高突变率，筛选出高产细胞株。第17页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学18（5）细胞融合和基因工程选择通过细胞融合方法以及基因工程的方法提高酶的含量。第18页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学19（6）高产系的选择方法①目测法对于含色素的株系筛选具有通用性。②放射免疫法仪器贵、合成放射性标记抗原困难、安全性差等，应用较少。③酶联免疫法方便、快捷、灵敏，在大规模筛选中前景广阔。④流动细胞荧光测定法局限于被测定细胞中目的酶在激光处理后能发出荧光。⑤流动细胞测定法限于测定能产生抑菌作用的次生产物的高产细胞系的筛选，需要选择一种特异敏感菌。第19页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学202.植物细胞培养的培养基

用于培养植物细胞的培养基已发展了几十年，尤其是最近30年才取得巨大进展。用于植物细胞培养的基础培养基营养成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基要满足各自特殊的要求，根据特定的植物种类和培养系统，基本营养成分可作适当的改进。植物细胞的培养基组分比较复杂，但是培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐和生长因子等几大类组分。第20页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学213.提高植物细胞产酶量的方法

在生产过程中为了获得较高的产酶量，首先要选择高产的培养材料，这在前面已经提到。与微生物产酶类似，植物细胞培养中也可以采用调节温度，调节pH，调节溶氧，调节光照，调节代谢途径，控制细胞的生长和分化的程度，加入诱导物或前体等方法，根据植物细胞的特点，还可以采用毛状根培养等技术提高产酶量。第21页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学22（1）温度的控制植物细胞培养的温度一般控制在室温范围(25℃左右)。温度高，对植物细胞的生长有利，温度低，则对次级代谢物的积累有利。但是通常不能低于20℃，也不要高于32℃。有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同，要在不同的阶段控制不同的温度。第22页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学23（2）pH的控制植物细胞的pH一般控制在微酸性范围，即pH5～6。培养基配制时，pH一般控制在pH5.5～5.8范围。在植物细胞培养过程中，一般pH变化不大。第23页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学24（3）溶解氧的调节控制植物细胞的生长和产酶需要吸收一定的溶解氧。溶解氧一般通过通风和搅拌来供给。适当的通风气搅拌还可以使植物细胞不至于凝集成较大的细胞团，以使细胞分散，分布均匀，有利于细胞的生长和新陈代谢。然而，由于植物细胞代谢较慢，需氧量不多，过量的氧反而会带来不良影响，加上植物细胞体积大、较脆弱、对剪切力敏感，所以通风和搅拌不能太强烈，以免破坏细胞。这在植物细胞反应器的设计和实际操作中，都要予以充分注意。第24页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学25（4）光照的控制光照对植物细胞培养有重要影响。大多数植物细胞的生长以及酶的生产要一定波长光的照射，并对光照强度和光照时间有一定的要求。因此在植物细胞培养过程中，应当根据植物细胞的特性以及目的次级代谢物的种类不同去进行光照的调节控制。尤其是在植物细胞的大规模培养过程中，如何满足植物细胞对光照的要求，是反应器设计和实际操作中要认真考虑并有待研究解决的问题。第25页,共44页，2024年2月25日，星期天（5）饲喂前体次级代谢产物的形成依赖于莽草酸、氨基酸和乙酸等3种主要原料的供应。第26页,共44页，2024年2月25日，星期天（6）诱导子应用触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子，加入诱导子可提高植物细胞次级代谢产物的产量并可促进产物分泌到培养基中。第27页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学28（7）毛状根培养技术毛状根是双子叶植物受发根农杆菌感染后产生的。感染过程中，发根农杆菌Ri质粒的T－DNA转移并整合到植物基因组中，在不添加外源激素的条件下，不仅生长迅速，而且毛状根具有器官化的特性，遗传性、生理、生化特性稳定，具有比悬浮细胞培养更强的酶合成能力。目前为止，诱导植物产生毛状根的种类已达百种以上，其中，大多数都能检测到接近于甚至高于原植株或其他培养物的酶产量。第28页,共44页，2024年2月25日，星期天4.植物细胞培养方法分批培养法半连续培养法连续培养法第29页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学30第九节动物细胞培养产酶动物细胞的特性动物细胞培养的特点动物细胞的培养方式培养的工艺条件及其控制第30页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学31一、动物细胞的特性 没有细胞壁，十分脆弱体积较大，略小于植物细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性营养要求复杂第31页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学32二、动物细胞培养的特点用于各种功能蛋白的生产细胞生长较慢需要添加抗生素体积大，无细胞壁，对剪切力敏感多数适宜帖壁培养，部分可以悬浮培养培养基成分复杂50代后即会退化死亡第32页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学33三、动物细胞的培养方式（一）贴壁培养（二）悬浮培养（三）微载体培养系统（四）包理培养（五）微囊化培养第33页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学34（一）贴壁培养分散的细胞总溶液在培养器中往往要贴附于壁上，这叫细胞贴壁。原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展呈多种形态。此后细胞就开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般在数天后就铺满生长表面，形成致密的细胞单层，叫做单层细胞，这种培养的方法又叫单层细胞培养。细胞培养中有一个非常有趣的现象是细胞的接触抑制。当贴壁生长的细胞生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖。长成单层的细胞经过一段时间，一定须在重新分散后分瓶继续培养，使其继续分裂增殖，也就是传代。第34页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学35（二）悬浮培养悬浮培养是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程，主要用于悬浮生长的细胞培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。由于动物细胞的特点，如没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气。因此，在许多方面又与经典的发酵有所不同。对于小规模培养多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。有许多动物细胞属于贴壁依赖性的，不能悬浮培养。第35页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学36（三）微载体培养系统滚瓶系统劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面积小，占用空间大，按体积计算细胞产率低，监测和控制环境条件受到限制。为了克服这些不利因素，1967年，vanWezel开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞。微载体是直径为60～250μm的微珠。采用微载体系统培养动物细胞，细胞贴壁于微载体上，微载体(和细胞)悬浮于培养基中，细胞逐渐生长成单层。这种模式，把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起，具有两种培养方法的优点。第36页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学37（四）包理培养包埋是一种固定化方式，包埋培养，对悬浮生长和贴壁依赖生长的细胞都适用，细胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对悬浮生长的细胞用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖生长细胞用胶原包埋。细胞固定化培养首先是用于微生物如酵母和细菌，由于其具有保护性强、能重复使用，易于连续操作，生长速率快，产品较纯等优点，而引起人们极大兴趣。动物细胞和微生物细胞相比，生长较慢，成本高，因此，需要重复使用。动物细胞对机械剪切力敏感，固定化对细胞的保护促进了其应用。第37页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学38（五）微囊化培养微囊化曾是一种酶的固定化技术。1987年Lim等发展了一种微囊化方法，实现了动物细胞的微囊化，它是在液体状态和生理条件下制备的，基本上对细胞的生长条件改变不大，因此使包埋的细胞能够成活，亦能培养生长。动物细胞微囊化后，与游离细胞比较，降低了培养时对细胞的剪切力。实际上微囊里面也是一种微小的培养环境与液体培养差不多，因而细胞生长良好，在培养过程中，微囊化也能提供很高的细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。

第38页,共44页，2024年2月25日，星期天四、动物细胞培养基天然培养基合成培养基无血清培养基第39页,共44页，2024年2月25日，星期天酶发酵动力学40四、细胞培养1.原代细胞培养2.传代细胞培养第40页,共44页，20