细菌形态学检查

关于细菌形态学检查两个分隔的世界

微生物人员的无奈标本采集不合格有些病原菌难以生长或生长周期长不是所有细菌都能做药敏试验不是所有培养出的细菌都是致病菌没有培养出细菌不代表没有感染不是所有细菌或所有药物都有判断标准临床医生不主动联系试验室人员临床医生的抱怨苛养菌检出率低结果重复性差报告速度慢感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差第2页,共25页，2024年2月25日，星期天关注微生物报告时效性问题操作最简单费用最低标本直接涂片用时最短显微镜检测结果最直观

可在第一时间向临床报告镜下所见，医生根据镜检结果可作初步诊断，并以此进行针对性用药。第3页,共25页，2024年2月25日，星期天主要内容标本涂片制作方法常用染色方法及技巧如何阅片第4页,共25页，2024年2月25日，星期天标本涂片制作方法痰液：棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml，均匀涂抹成卵圆形痰

膜（约2cm长），每张玻片只涂一份标本脓液：同痰涂片大便：取粘液便或血便少量均匀涂布玻片，不可过厚无菌体液：标本足量，>1ml，离心或甩片集菌后涂片(3000r/min15min）

标本量少，直接涂片病灶组织或干酪块：先用组织研磨器磨碎后再涂片，大小厚度同痰涂片，

注意丝状真菌

第5页,共25页，2024年2月25日，星期天质量控制涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜染色结果细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清楚可见革兰染色阴、阳性分明

涂片的制备水平及染色的质量，直接影响到镜检的结果第6页,共25页，2024年2月25日，星期天标本染色方法及技巧根据检测目标的不同选择最适合的染色方法病原体染色方法细菌、真菌革兰染色真菌10%KOH、乳酸酚棉蓝新型隐球菌墨汁染色结核分枝杆菌抗酸染色、荧光染色奴卡菌弱抗酸染色耶氏肺孢子菌六胺银染色细胞壁缺陷菌吖啶橙染色第7页,共25页，2024年2月25日，星期天革兰染色涂片固定待涂片干后加热固定，火焰固定时菌膜朝上，以中

等速度通过火焰3此即可（温度不宜过高，以防菌体蛋白

变性，影响染色结果），也可用乙醇或甲醇固定。染色

龙胆紫10s水洗甩干

碘液10s水洗甩干

脱色液10-20s水洗甩干

沙黄10s水洗待干镜检油镜下观察，紫色→革兰氏阳性

红色→革兰氏阴性第8页,共25页，2024年2月25日，星期天革兰染色注意事项注意取材部位，涂片的厚薄。染色时间应视标本种类、涂片厚薄调整，妇科白带标本染色时间应烧延长（>10s）,以获得更好的染色效果。脱色不宜过度。固定不可用酒精灯直接加热，避免影响染色效果。染液用完后及时改上盖子，避免挥发。被检菌的培养条件、培养基条件、菌龄的不同影响染色效果，如培养时间过长，革兰阳性菌可能染成阴性。18—24小时为宜。某些菌存在染色困难，不易脱色的情况，出现染色不均，阴阳不定（某些G+b、鲍曼不动杆菌等）。注意生物安全，自我防护。第9页,共25页，2024年2月25日，星期天抗酸染色涂片固定同革兰染色染色

石碳酸复红≥10min水洗甩干

酸性酒精1-2min水洗甩干（必要时可重复）

亚甲基蓝30s水洗待干

合格的片子肉眼观察痰膜呈亮蓝色，无红色斑块镜检抗酸菌呈红色，背景及其他菌呈蓝色第10页,共25页，2024年2月25日，星期天第11页,共25页，2024年2月25日，星期天抗酸染色注意事项染色时避免玻片上的染液干燥直接涂抹的痰膜厚薄适宜，以透过痰膜看报纸上的5号字迹较模糊为适宜的厚度香柏油能溶解复红染料，使萋-尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成伤害，故避免使用香柏油，应使用专用油镜油酸性酒精用尽，可自制5%的盐酸酒精作为脱色液有时同一个抗酸菌体上，红色的深浅亦有不同，镜检时注意冬季室温过低，染色时间适当延长试剂用完后及时盖好，避免挥发注意生物安全，自我防护第12页,共25页，2024年2月25日，星期天墨汁染色标本（脑脊液）离心取沉淀涂片在标本涂片处滴加1滴墨汁，加盖玻片在低倍镜下找有荚膜的菌细胞，转高倍或油镜确认结果：新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，细胞壁明显，有时有出芽现象，背景黑色

注意事项

脑脊液与墨汁的最适比例，墨汁太多影响观察脑脊液离心后涂片，离心10-30min痰液、支气管灌洗液均可作为隐球菌的检测标本，防止漏检第13页,共25页，2024年2月25日，星期天乳酸酚棉蓝染色在玻片上滴加1滴乳酸酚棉蓝染液剪一段约1cm长的透明胶带，将一端贴在棉拭子木棒的一端，形成旗帜样将胶带粘性一面按在菌落表面，将菌丝粘在胶带上并平放进入染液，取下木棒，再胶带表面再滴加一滴染液，盖上盖玻片使用显微镜在低倍镜、高倍镜或油镜下观察真菌形态

第14页,共25页，2024年2月25日，星期天科兹洛夫斯基染色涂片，可混合大肠杆菌做对比，干燥、固定滴加2%沙黄水溶液，略加热，使之冒蒸汽，约30s—1min后水洗1%孔雀绿染液复染2—3min，也可用碱性美蓝染色1—2min吸水纸吸干后镜检结果布氏杆菌呈淡红色球杆菌，其它菌或细胞呈绿色或蓝色第15页,共25页，2024年2月25日，星期天六胺银染色涂片固定染色

1%高碘酸，氧化10min，流水冲洗2%铁明矾10min,流水冲洗

玻片放入60℃预热20min的工作液中40min左右，每5min观察

一次，至涂片呈淡褐色，流水冲洗0.2%氯化金调色3—5min，流水冲洗2%硫代硫酸钠固定3min，流水冲洗

置60℃烤箱内烤干，封片结果油镜下肺囊虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则形，包囊呈黑色第16页,共25页，2024年2月25日，星期天质量控制每天质控与标本同步进行一年一次人员比对，以当次比对职称最高人员结果为参考标准染色方法质控菌株结果革兰染色ATCC25923（金黄色葡萄球菌）ATCC25922（大肠埃希菌）紫色红色抗酸染色ATCC14468（耻垢分枝杆菌）ATCC25922（大肠埃希菌）红色蓝色第17页,共25页，2024年2月25日，星期天阅片第18页,共25页，2024年2月25日，星期天如何阅片标本合格与否的判定感染的确认（炎症细胞）炎症性质的鉴别（单个核、分叶核或嗜酸细胞）感染性质鉴别（细菌、真菌、螺旋体、寄生虫等）微生态失衡与否及程度（菌群失调）可疑致病菌的确认（根据微生物与炎性细胞的关系）第19页,共25页，2024年2月25日，星期天首先判断标本合格与否开放性标本（痰液、尿液、伤口标本等）肉眼观察（痰液粘稠、脓性、血性）根据镜下细胞种类，数量及细菌种类判断上皮细胞多，炎症细胞少，多不合格第20页,共25页，2024年2月25日，星期天强烈提示感染的镜下现象吞噬现象

包括中性粒细胞的非特异性吞噬和巨噬细胞的特异性吞噬，与粘附区别第21页,共25页，2024年2月25日，星期天包裹现象

有些病原微生物自身具有抗吞噬能力（荚膜），炎性细胞不能将

其吞噬，而是包裹起来，形成脓球第22页,共25页，2024年2月25日，星期天

伴行现象

未被炎性细胞包裹的病原菌分布在炎性细胞周围，需与污染菌鉴别

第23页,共25页，2024年2月25日，星期天建议对大家公认有临床致病意义的细菌：结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、奴卡菌、白喉棒状杆菌、隐球菌等一经检出应立刻报临床。对来自无菌部位的标本并排除污染的镜下细菌一经检出立刻报临床。呼吸道及其他污染部位的条件致病菌（肺炎链球菌、嗜血杆菌、卡他莫拉菌铜绿假单胞菌、不动杆菌等）需结合镜