《动物细胞培养和核移植技术》课件

克隆羊“多莉”“人耳鼠”再出风头

2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动——这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。

长有人耳的小白鼠

英国科学家近日用患者自身的细胞制成一种名为“我的皮肤”的生物活性绷带，它给皮肤烧伤病人带来了福音。他们先从患者身上采集一些细胞样本，再让其在特殊的膜片上增殖。5至7天后，就可以将这种特殊膜片敷在患者的伤口上，膜片会将患者自身的细胞逐渐“释放”到伤口，并促进新生皮肤层的生长，达到加速伤口愈合的目的。

以上资料，透露了怎样的信息？动物细胞工程常用的技术手段动物细胞培养—基础动物细胞融合单克隆抗体制备应用核移植自探提纲1动物细胞培养的过程2原代培养与传代培养3动物细胞培养的条件及应用4体细胞核移植的过程5体细胞核移植的应用前景一、动物细胞培养为什么要进行动物细胞培养？材料一：在治疗烧伤病人时，通常是取病人的健康皮肤进行自体移植。对于大面积烧伤的病人，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，且会产生排斥反应。怎样才能获得大量的自体健康皮肤呢？材料二：许多动物细胞能分泌蛋白质，如抗体等。但是，单个细胞产生的蛋白质很少，怎样才能获得大量的分泌蛋白呢？一、动物细胞培养2、过程：阅读课本P44-45取动物组织块剪碎组织用胰蛋白酶处理分散成单个细胞转入培养液，制成细胞悬液进行原代培养贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，制成细胞悬液转入培养液中进行传代培养放入二氧化碳培养箱中培养取什么样的材料好？幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？为什么动物细胞要分散成单个细胞培养?用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？

什么叫原代培养？什么是传代培养？用概念图的方式完成细胞培养的流程图动物细胞培养中会出现什么特点？

1957年，科学家采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对细胞培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养成为细胞培养普遍应用的技术。小知识在科学研究中，有时需要明确界定培养液的成分，而血清中由于含有许多未知成分，会对研究结果有影响，因此，在进行细胞培养时，也可采用无血清培养。无血清培养基是在基本培养基中，添加一些已知的促进细胞生长和增殖的物质。小知识一、动物细胞培养4、动物细胞培养技术的应用：大规模的生产有重要价值的生物制品为基因工程提供受体细胞检测有毒物质，判断毒性用于生理、病理、药理等方面的研究阅读课本P46——47小结：动物细胞培养特点原理概念：贴壁生长，接触抑制动物组织胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液细胞悬液分瓶培养10代细胞50代细胞不死细胞原代培养传代培养细胞株细胞系适宜条件培养条件应用无菌无毒，营养，温度、PH，气体环境过程细胞增殖植物组织培养和动物细胞培养的比较细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体更多细胞快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白个体水平细胞水平用离体的植物组织或细胞能培养成完整的植株，一个动物细胞能否培育成完整动物体？1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。能不能用高产奶牛的一个体细胞，培养出一头高产奶牛呢？

高度分化的植物组织仍保持着全能性，动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐变弱。目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整动物个体，用动物体细胞克隆的动物，实际是通过核移植来实现的。2、体细胞核移植的过程阅读课本P48的流程图MII期的卵母细胞做受体细胞，卵细胞体积大，易于操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。将体细胞核移植入去核卵细胞内，既保证了重组细胞的完整性，又能刺激体细胞核表达其全能性，发展成为一个新的个体。

在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？

为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。

用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，这是为什么？

培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。

（以克隆高产奶牛为例）核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？为什么选用该细胞？你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？克隆牛的遗传物质主要来自谁？

克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。

动物体细胞核移植产生的新个体的亲本有三个：体细胞核供体、卵细胞细胞质供体、代孕母体。新个体细胞核基因型与体细胞核供体完全一样，因此新个体性状与体细胞核供体基本相同。卵细胞细胞质中也有少量的DNA，新个体性状与卵细胞细胞质供体有一些地方相同。代孕母体没有为新个体提供遗传物质，新个体性状与代孕母体基本没有联系。动物体细胞核移植产生的新个体涉及的亲本有几个？与克隆动物在遗传上是什么关系？

2、体细胞核移植的过程以概念图的形式表示体细胞核移植过程？取供体细胞取卵母细胞

供体细胞培养培养到MⅡ中期

卵母细胞去核

供体细胞注入去核的卵母细胞

供体核进入受体卵母细胞

重组细胞

代孕母牛

生出与核供体遗传物质基本相同的个体早期胚胎此过程用到了哪些生物学技术？繁殖方式是什么类型？细胞培养核移植技术胚胎移植细胞培养2、体细胞核移植的技术流程生殖方式——遗传物质来源——后代性状表现——电激处理细胞培养无性生殖主要来自供体细胞核，少量来自卵细胞质主要与核供体相似，少量性状与卵供体相似

美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。

思考与探究：

可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。但同时需注意，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？

首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。

小知识

2001年我国科学家将牛耳细胞克隆的胚胎移入135头牛体内，每头牛移植了两枚克隆胚。从2002年1月8日起，陆续获取了14头克隆牛犊。至2003年11月，这批被克隆的牛，存活的只有5头。二、动物体细胞核移植技术和克隆动物4、存在的问题：阅读课本P50

体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。

研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。

应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。小结：二、动物体细胞核移植技术和克隆动物

动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.2、过程：3、应用：4、问题：卵母细胞采集MⅡ期卵母细胞去核供体牛供体细胞注入去核卵母细胞供体细胞培养电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母牛克隆牛1、概念：练习1.（2009浙江）用动、植物体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是()

A.都需要CO2培养箱 B.都须用液体培养基

C.都要在无菌条件下进行D.都可体现细胞的全能性C2.（10浙江）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是（）A培养保留接触抵制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞B克隆培养法培养过程上多数细胞的基因型会发生改变C二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的D恶性细胞系的细胞可进行传代培养D练习3.(2008年宁夏高考)回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面______时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是______________。(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成________细胞，该种细胞的黏着性________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量___________。相互接触接触抑制单层(一层)胰蛋白酶衰老甚至死亡不死性降低减少(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是______________________________________________(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到______期的细胞用显微镜进行观察。(5)在细胞培养过程中，通常在________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中________的活性降低，细胞________的速率降低。(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作_______进行攻击。由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内(或由于死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色)中冷冻(或超低温、液氮)酶新陈代谢抗原

细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。一般取胚胎细胞或幼龄动物的器官组织进行细胞培养。

成块的组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增殖，分散成单个细胞后培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。

用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。

胰蛋白酶不会把细胞消化掉吗？为什么？

胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须