蛋白定量与纯度分析

关于蛋白定量与纯度分析第一节蛋白质定量分析1概况1.1蛋白含量蛋白质定量分析通常是指测定蛋白质溶液中的蛋白质的量或蛋白质粉剂中蛋白质的量。在进行蛋白质含量测定时，首先根据蛋白质的物理化学性质的特性和实验室的现有条件来确定测定方法。蛋白质含量测定方法有很多，大致可以分为四类，重量法定氮法比色法氨基酸推算法等第2页,共52页，2024年2月25日，星期天

采用的测定方法不同得到的测定结果有差异。每-种方法有它独特的优点，但是也有它的局限性。。在上述几种测定方法中测定的数据最准确的，最可靠的属于定氮法和氨基酸推算法。这两种测定方法都是通过测定分子中的氮元素或分子结构来确定蛋白质含量的。因此，测得的数据相对比较准确，但是它的实验步骤比较多，操作比较繁琐。其他的测定方法相对简单一些，是实验室常用的技术，灵敏度相对低一些。测定蛋白质含量通常要采用两种以上的方法，要根据蛋白质的某些特性选择不同的方法进行测定。将多种方法测得的结果综合考虑。第3页,共52页，2024年2月25日，星期天1.2蛋白质浓度测定蛋白质定量分析的方法很多，采用的定量分析方法不同其测定的基本原理也同；得到的结果有一定的差异。每一种测定方法有它的优点，也有它的不足之处。在实际工作中要根据蛋白质的特性采取相应的方法。在诸多分析方法中使用的最多的是比色法。下面分别简单介绍各种定量分析的基本原理和方法。第4页,共52页，2024年2月25日，星期天1.3测定基本条件待测溶液在一定的波长照射下会产生光吸收，在一定的浓度范围内光吸收值的大小与溶液浓度成正比。因此只要测出待测溶液的光吸收值和基准溶液的光吸收值。便可知道待测溶液的浓度，推算出蛋白质的含量。比色分析要考虑以下几个条件：(1)溶液在蛋白质的定量分析中，大部分都足采用比色法，而比色法的溶液可分两大类，即一类是有色溶液，另一类是无色溶液。第5页,共52页，2024年2月25日，星期天1.

a.有色溶液这是根据蛋白质与某些化中试剂反应生成的一类有色溶液，该溶液能与单色光具有互补作用，生成互补色。利用光的互补原理进行比色测定。有色溶液包括以下二种本色溶液：蛋白质分子中含有变色基团或显色基团，在溶液中会产生颜色，如血红蛋白，血蓝蛋白，铁蛋白，细胞色素C等。显色溶液：蛋白质与某些化学试剂反应产生颜色，如双缩脲，福林酚，茚三酮等试剂。染色溶液：蛋白质与某些燃料结合，被染上颜色，如考马斯亮蓝，氨基黑等染料。第6页,共52页，2024年2月25日，星期天b.无色溶液根据蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，在280nm处有最大吸收峰，肽键在215nm处有最大吸收峰，利用最大吸收峰的特性进行比色测定。第7页,共52页，2024年2月25日，星期天(2)单色光单色光的互补性：有色溶液与相应的单色光生成新的互补色第8页,共52页，2024年2月25日，星期天(4)朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)

朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)，也称之为光吸收定律。比色测定要完全遵循朗伯-比耳定律。是指在一定的浓度范围，溶液的浓度与光吸收值成正比。用公式表示为：

光吸收值(A)=lg(1/T)=KCLT为透射比，K为常数，C为溶液浓度，L为光程（吸收层厚度）朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度L和浓度C对光吸收的关系，测定的光吸收值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质不同而变化。第9页,共52页，2024年2月25日，星期天2测定方法：2.1比色测定2.1.1双缩脲法：(1)原理蛋白质分子中含有肽键(CO-NH-)，因此，具有双缩脲反应的特性。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色的络合物，络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正。所以它是蛋白质和肽类物质的特异性测定方法。但此法测定灵敏度不高，一般测试浓度在1-10mg之间，尤其适合于肽类物质的测定。第10页,共52页，2024年2月25日，星期天(2)方法：将蛋白溶液和双缩脲试剂显色反应，然后在540nm处比色测定，以牛血清清蛋白或者以被测蛋白标准品为基准液绘制标准曲线。(3)影响因素：干扰双缩脲测定的因素包括：在性质上类似于氨基酸的化合物，如有机胺类肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂，可使Cu2+还原，出现红色沉淀物，干扰测定。第11页,共52页，2024年2月25日，星期天2.1.2福林-酚(Lowry)法：(1)原理：福林-酚法测定蛋白质是在双缩脲法的基础上发展起来的。是在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色的络合物，然后该络合物再与还原磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生深蓝色溶液。此法适合于蛋白类的定量分析，灵敏度较高，测试范围在25-250μg之间，但专一性不强。(2)方法：将蛋白溶液利福林-酚试剂生成颜色反应，然后在640nm处比色测定，以牛血清清蛋白或者以被测蛋白标准品为基准液绘制标准曲线。(3)影响因素：干扰此测定的因素包括：在性质上类似于氨基酸或肽的缓冲剂。如呈色反应，Cu2+容易被还原，出现红色沉淀物，干扰测定。

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2.1.3考马斯亮蓝法：(1)原理：考马斯亮蓝G250是一种甲基取代的二苯基甲烷，分子中含有多个磺酸基的染料，在465nm处有最大光吸收值。考马斯亮蓝G250的磺酸基能与蛋白质结合形成复合物，引起该染料的最大光吸收值的位置发生位移，移至595nm处出现最大光吸收值。由于蛋白质-染料复合物具有很强的光吸收，可大大提高测定蛋白质的灵敏度，对蛋白类的定量分析，最低测试量在1μg以上。第13页,共52页，2024年2月25日，星期天(2)方法：将蛋白溶液和考马斯亮蓝G-250试剂反应生成深蓝色，然后在595nm处比色测定。以牛血清清蛋白或者以被测蛋白标准品为基准液绘制标准曲线。(3)影响因素：某些去污剂如Triton-100，SDS等对测定均有一定的干扰。

第14页,共52页，2024年2月25日，星期天2.2紫外光吸收法：2.2.1标准曲线法(1)原理：蛋白质分子中含有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸，组氨酸的等)，在280nm处有最大吸收峰。蛋白质在最大吸收峰λmax波长处的吸光值的强弱与蛋白的浓度成正比。这种方法适合于蛋白质分子中含有较多芳香族氨基酸的蛋白质进行定量分析，对某些含芳香族氨基酸较少的蛋白质，测定灵敏度较低，如胶原蛋白。第15页,共52页，2024年2月25日，星期天(2)方法：在实际工作中紫外光吸收法最常用的一种蛋白质方法，它是以配制一系列不同浓度的蛋白质标准溶液．以不含被测蛋白的溶液为参比溶液，在同样条件下测定标准溶液的吸光度，将测得的数据绘制成标准曲线，然后在同样条件下测定未知样品的吸光度，从标准曲线上查得未知样品的浓度。此法测量比较准确，但使用的标准曲线隔一段时间进行校正。第16页,共52页，2024年2月25日，星期天2.2.2消光系数法：(1)原理：蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，在280nm处的特定吸光值。蛋白质分子中所含氨基酸数量不同，它们在280nm处吸光值的强弱就有差异。因此，每一种纯的单一蛋白质在280nm处有一个特定的消光系数。如果已知某个蛋白质的消光系数，只要在280nm处测定出该蛋白吸光值就可以计算出其相应的含量。计算公式如下：第17页,共52页，2024年2月25日，星期天

测得吸光值×N×1000测得吸光值×N×10蛋白质浓度(mg/m1)==

消光系数×100消光系数

式中的N为稀释倍数，10是常数，是指在标定消光系数时，蛋白溶液的浓度为100ml溶液中含有1000mg蛋白质，在计算公式中约分得到常数10。

第18页,共52页，2024年2月25日，星期天例如：胰蛋白酶的消光系数是13.5。将胰蛋白酶溶液稀释100倍，测得的光吸收值是0.27，通过上述公式计算其浓度。

0.27×100×10

蛋白质浓度(mg/m1)==2013.5

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(2)方法：将待测蛋白稀释成一定浓度在280nm处测定吸光值(测得的吸光值处落在0.1-1.0范围内)。(3)影响因素：在蛋白质的混合溶液中或在280nm有干扰物质存在时，对该溶液测定均有较大的影响。不具有普遍性。测试灵敏度所不同。第20页,共52页，2024年2月25日，星期天2.2.3F因子测定法(1)原理：由于蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质。最大吸收峰的波长在280nm处。而在波长260nm处光吸收较弱。这两种波长吸光值的强弱与浓度成正比。通过测定蛋白质溶液在280nm和260nm处的光吸收值，求出A280/A260的比值，从表中查出F因子，通过计算公式可以计算出待测蛋白质的含量。第21页,共52页，2024年2月25日，星期天

蛋白质浓度(mg/m1)=F×(l/d)×A280×NF：F因子

d：比色杯的厚度

N：稀释倍数(2)方法取一定浓度的蛋白溶液，分别测定280nm和260nm处的光吸收值。求出A280/A260的比值，从F因子表中查出F因子。紫外吸收法测定蛋白质含量A280／A260的比值与F因子的关系见表1第22页,共52页，2024年2月25日，星期天

表1紫外吸收法测定蛋白质含量F因子表1A280/A269F因子A280/A269F因子1.751.1160.8460.6561.631.0810.8220.6321.521.0540.8040.6071.401.0230.7840.5851.360.9940.7670.5651.300.9700.7520.5451.250.9440.7300.5081.160.8990.7050.4781.090.8520.6710.4221.030.8140.6440.3770.9790.7760.6150.3220.9390.7430.5950.2780.8740.682

第23页,共52页，2024年2月25日，星期天2.3定氮法4.3.1凯氏定氮法：(1)原理：因为每一种蛋白质都有其恒定的含氮量(约为14-16％)，只要测出其氮元素的含量就可以推算出其蛋白质的量。因此，可以通过测定有机化合物或蛋白质分子中氮元素的含量来推算蛋白质的含量。计算公式如下：蛋白质(mg/ml)=测得的含氮量×14×6.25

凯氏定氮法是将含氮有机化合物或蛋白质与浓硫酸共热硝化，有机氮转变成氨，氨又与硫酸结合生成硫酸铵，硫酸铵在碱性条件下被分解，放出氨气，用水蒸汽蒸馏将氨气蒸出，硼酸吸收，然后用标准碱溶液进行滴定。第24页,共52页，2024年2月25日，星期天

(2)实验方法：蛋白质→消化→氨→硫酸铵→氨→硼酸铵→滴定→含氮量→蛋白质含量。凯氏定氮法是一种经典方法，灵敏度高，使用的仪器比较简单，但操作比较繁琐，影响的因素较多，日前使用的不多。(3)影响因素:空气中的氨气,标准碱的浓度第25页,共52页，2024年2月25日，星期天凯氏定氮装置1.安全管2.导管3.汽水分离管4.样品入口5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发生瓶第26页,共52页，2024年2月25日，星期天2.3.2原子吸收光谱法(1)原理：基本理是通过原子灯发出的被测元素的特征谱线在通过原子化器时，被待测元素的基态原子所吸收，使原子灯发出的被测元素的特征谱线强弱发生改变，通过检测特征谱线的变化来测定原子吸收光谱，利用这些光信号的变化的强弱测定化合物中各种元素的含量。利用这一性质，通过原子吸收光谱仪测定蛋白质中的氮元素便可计算出蛋白质的量。(2)方法：通过原子吸收光谱仪直接测定蛋白质的氮元素，或者通消化后测定消化液中氮元素。这种经典方法的测试灵敏度高，操作比较简单，但需要大型的原子光谱仪，一般的实验室不具备。第27页,共52页，2024年2月25日，星期天2.4重量法：(1)原理：在溶液中同时存在挥发性溶剂和非挥发溶质，结冰的溶剂在高真空度的条件下直接升华，溶质被干燥，获得蛋白质干粉，然后进行重量分析。(2)方法：精确吸取一定的蛋白质溶液冻干，恒重后，称重，即得蛋白质重量。这种方法适用于比较珍贵的样品，重量法要求的天平的精度比较高。

第28页,共52页，2024年2月25日，星期天3定量分析应注意的问题要使分析方法有较高的灵敏度和准确性，选择最佳的测定条件：是十分重要。它包括仪器测量，试样反应和参比溶液等条件。2.1光学仪器的最小测量误差：任何分光光度计都有一定的测量误差，这是由于光学系统稳定性的差异所造成的，实验条件的瞬间变化，导致读数波动，对测定结果的准确性有一定的影响，尤其是试样浓度过高或过低均会引起的误差。因此，测定时合适的吸光度测量范围是很重要的。根据Lamber-Beer定律，可以推出测定结果的相对误差。第29页,共52页，2024年2月25日，星期天

若要使测定结果的相对误差最小，通过Lamber-Beer定律的方程解，从理论上得出相对误差最小值是：吸光度(A)=0.434

透光率(T)=36.8％。

也就是说吸光度读数应控制在光谱仪上最灵敏的范围内，

(A)=0.434、(T)=36.8％。是仪器误差最小的。第30页,共52页，2024年2月25日，星期天

浓度测量的相对误差与溶液透射率(T)的关系如图所示：图1

第31页,共52页，2024年2月25日，星期天3.2比色测定呈色反应在定量分析中，有许多物质的测定是通过化学反应生成颜色后再进行比色测定，一般要注意下列问题(1)颜色反应后的生成物必须在选定测定波长有较大的光吸收(2)颜色反应后生成物理化性质必须稳定，显色条件容易控制，重复性好(3)对照性好，反应物和生成物之间的最大吸收波长之差，差值一般要在60nm以上。第32页,共52页，2024年2月25日，星期天

3.3参比溶液的选择根据样液的性质不同，可选择不同的参比溶液。(1)溶剂参比：当样液的组分比较简单，与其它组分共存对所测定波长无任何吸收剂为参比。(2)溶液参比：参与反应的试剂在所测定波长部分干扰，可按照显色反应的条件，选用不加被测试样品的溶液为参比。(3)纯水参比：试样与共存组分在测定波长均有较大的吸收，可选用水为空白，先测出试样和对照的光吸收值，然后用试样的吸收值减去对照的光吸收值即可。第33页,共52页，2024年2月25日，星期天.

4定量分析小结

方法机理关键技术优点缺点比色法光互补色呈色反应应用广泛影响因素多紫外法最大吸收峰蛋白质纯度操作简单基准物有局限定氮法转化氮元素蛋白质消化结果准确步骤繁琐重量法冰点升华样品恒重结果准确专一性差第34页,共52页，2024年2月25日，星期天第二节蛋白质纯度1概念1.1蛋白质纯度蛋白质的纯度分析，是从蛋白质样品中确定目标蛋白和杂质的分析方法，也是蛋白质分析中的一类重要方法。任何一个蛋白质制品从理论上说都含有二类组分，即蛋白质和杂质。蛋白质：是样品中主要的成分，是分析的目标蛋白杂质：是残留的非目标蛋白和残留的小分子，无机盐等因此，蛋白质纯度分析方法大致分为两类。第35页,共52页，2024年2月25日，星期天(1)目标蛋白与杂蛋白的分析(2)目标蛋白与非蛋白的分析从广义上说蛋白质纯度一般是指样品中是否含有杂蛋白的，不包括无机盐和有机小分子的分析鉴定。因为有些蛋白质要在一定无机盐和有机小分子的保护下才比较稳定。因此，某些产品中要添加一些小分子化合物。但是如果要进行蛋白质的含量测定，则要包括杂蛋白，无机盐和有机小分子的测定。第36页,共52页，2024年2月25日，星期天1.2蛋白质纯度的表示方法一个天然蛋白或一个重组蛋白质，产品的纯度是一个重要的指标。纯度的表示方法主要根据实际用途区分。如化学试剂的纯度一样，主要有化学纯，分析纯，优级纯等。蛋白质的纯度通常有两种方式表示。(1)工业用的用百分含量表示：如：95％、99％、99.9％(2)实验室用的以用途表示：有实验室级纯(1ab)

电泳纯(electrophoresis)

色谱纯(choromatography)。第37页,共52页，2024年2月25日，星期天2分析的方法：2.1光谱法：2.1.1光谱扫描法：一种纯度的蛋白质溶液在一定的波长范围内进行光谱扫描就会得到一个特征吸收光谱，可以根据扫描光谱的吸收曲线的形状，吸收峰的位置，数量和大小判断该蛋白的纯度。用紫外吸收光谱测定样品的纯度，既方便又灵敏，测得结果可靠，是常用的纯度分析方法。光谱分析的特点：主要是鉴别目标蛋白质和非蛋白类杂质。第38页,共52页，2024年2月25日，星期天

2.1.2光吸收比值法：一种纯物质在紫外光区有其最大光吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白质的最大吸收峰在280nm。同一溶液在这两种波场下测得的光吸收值是不同的。利用在280nm和260nm处测得的光吸收值之比，即可得到蛋白质的纯度。如纯核酸的标准光吸收比为A280/A260=0.5、纯蛋白的标准光吸收比为A280/A260=1.8。特点：仅限于蛋白质溶液中含有核酸或核酸溶液中含有蛋白质的纯度测定。

含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260(mg/ml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的第39页,共52页，2024年2月25日，星期天

2.2层析法：2.2.1原理：一个纯的蛋白质在稳定的层析条件下，得到的保留值只有一个，如果得到的层析峰多于一个就可以视为不纯。所以根据层析峰的数量判断物质的纯度。层析法鉴定蛋白质纯度的方法有：(1)保留值法在一定的层析条件下各种蛋白质组分在层析柱内的保留值是一定的，通过测定蛋白质的层析保留值(保留时间，保留体积)就能确定蛋白质组分，从而可以判断蛋白质的纯度。如：排阻层析根据蛋白质不同的分子量可得到不同的保留体积，若流速恒定的条件下，其保留时间也是一定的。图2

第40页,共52页，2024年2月25日，星期天第41页,共52页，2024年2月25日，星期天

(2)基准物标定法：已知物内标法，在被鉴定物的样品中加入己知基准物，称内标物。通过层析分离，从得到的层析峰的增高或峰的位置来判断。图3第42页,共52页，2024年2月25日，星期天

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2.2.2层析的模式层析分析鉴定法的方法很多，但根据层析的分离机理利方法来分类，大致可分为以下几类。根据蛋白质质量和分子形状的层析分离模式根据蛋白质疏水基团多少和分子极性的差异的层析分离模式根据蛋白质的带电荷多少和分子吸附基团的差异的层析分离模式。常用的分离模式有：排阻层析疏水层析吸附层析高效液相第44页,共52页，2024年2月25日，星期天(4)几种色谱方法的比较方法机理关键技术优点缺点排阻层析分子量分离层析介质应用广泛分析时间长疏水层析极性分离缓冲溶液分离度好盐浓度较高吸附层析电荷分离介质性质通用性好条件难控制高效液相极性分离溶剂系统灵敏度高高纯有机溶剂第45页,共52页，2024年2月25日，星期天2.3电泳法：2.3.1原理：一个纯的蛋白质在一定的电泳条件下得到的电泳图谱只有一个条带，如聚丙烯酰胺电泳(PAGE)。所以根据蛋白质的电泳条带的数量判断蛋白质纯度。2.3.2方法：电泳鉴定蛋白质纯度的方法有:

净电荷电泳(PAGE)SDS-电泳(SDS)

等电聚焦电泳(IEF)

双向电泳(2D)

毛细管电泳(