单细胞藻类培养

单细胞藻类培养

CompanyLogo一、单细胞藻类的种类与生物特性（一）单细胞藻类培养的种类常用的饵料微藻主要有：牟氏角毛藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体CompanyLogo三角褐指藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体、种贝；CompanyLogo中肋骨条藻：虾、蟹幼体；CompanyLogo底栖舟形藻：鲍、海参、海胆、埋栖贝类、舔食螺类的附着幼体CompanyLogo底栖卵形藻CompanyLogo等鞭金藻：贝、虾、蟹、海参、海胆的幼体CompanyLogo亚心形四片藻：轮虫、卤虫、种贝及虾的后期幼体CompanyLogo海水小球藻CompanyLogo钝顶螺旋藻：虾、蟹幼体及配合饲料的添加剂CompanyLogo（二）单细胞藻类的生物学1、盐度：大多数单胞藻盐度适应范围很宽。10-40大多数单胞藻能适应。如扁藻、盐藻、小球藻在10-80的盐度中能正常生长。CompanyLogo2、温度①适温绿色巴夫藻：10-35℃扁藻：7-30℃盐藻：4-40℃因此大多数单细胞藻类适合在20-25℃下培养。一些单胞藻适合在较高温度下生存；如钝顶螺旋藻生存最适为28-34℃。CompanyLogo②低温单胞藻一般忍耐性较强，在一定的低温条件下产生的形态和生理变化是可逆的。利用其在低温环境下呈休眠状态的特点，可较长时间保存单细胞藻类。如在-20℃温度下，冰冻20d的三角褐指藻浓缩藻液，解冻后，培养2d即可恢复正常生长。CompanyLogo3、光照5000-10000lx，适合大多数单细胞藻类的培养。某些藻类适合在弱光下培养：如中肋骨条藻：5000lx较适宜，而10000lx产生抑制作用）三角褐指藻：3000-5000lx某些单细胞藻适合较强的光照：等鞭藻：7000-9000lx角毛藻:10000-15000lx某些单细胞藻类适合在强光下培养：如钝顶螺旋藻：30000-35000lx。CompanyLogo4、pH7.5-8.5是大多数藻类的适宜范围。也有一些藻类适合碱性条件：如钝顶螺旋藻：8.6-9.5。CompanyLogo5、繁殖主要以二分裂繁殖为主。可将培养过程分为：延缓期、对数（指数）生长期、相对生长下降期、静止期和衰亡期。二、藻种的分离（一）采样个体较大的浮游藻类，可用密浮游生物网在水中捞取。但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料微藻，一般个体很小，往往在几微米到十几微米，用浮游生物网无法采集到，需要把水样采回实验室处理。水样采回后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的藻种，而这种藻种的数量较多时，可立即进行分离，若数量少，必须先经过预备培养，待数量增多后再分离。二、藻种的分离（二）预备培养1、容器：通常采用三角烧瓶。2、培养液：

土壤抽出液Ⅰ:取土壤1kg，加纯水1000ml，煮沸60min，在暗处放置2d，过滤，以滤液600ml加纯水400ml。土壤抽出液Ⅱ：取土壤1kg，加纯水1000ml，再加入NaOH2-3g，煮沸120min，冷却后过滤，滤液直接使用。土壤抽出液Ⅲ：取土壤1kg，加纯水2000ml，煮沸煎浓，把上部泥浆倾入烧瓶中澄清，静置一昼夜后，次日吸取上清液，再煮沸煎浓。第三天在如法煎浓，最后倾入三角烧瓶中，加棉花塞，煎浓，直至得到1000ml的深褐色的土壤抽出液。每次使用后，煮沸灭菌保存。二、藻种的分离（二）预备培养1、容器：通常采用三角烧瓶。2、培养液：

土壤抽出液Ⅳ：取田园土壤1kg，加水2000ml，搅拌均匀，浸泡，用前吸取上清，煮沸消毒后使用。海泥（或土壤）抽出液Ⅴ：用海滩上砂质较少，有机物较多而又不是过分淤黑的上层软泥，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分搅拌均匀，静置1-2min，待粗砂，小石沉下，把上层泥浆倾入铝锅内，弃去底部粗砂，小石等杂物。静置24h，吸取上清液使用。二、藻种的分离（二）预备培养3、管理①搅动或摇动浮游种类应每天摇动一次。附着种类应静置不动。②经常观察，掌握时机及时分离：如发现藻类呈淡淡颜色，即进行显微镜检查，如需分离藻类已占优势，应立即进行分离。如没有需要分离的藻类，便重新进行采样及预培养。二、藻种的分离（三）分离方法1、微吸管分离法选直径约5mm的细玻璃管，在酒精喷灯上加热，待熔，快速拉成口径极细的微吸管。微吸管的另一端套接一条长约30cm或8cm的医用乳胶管。在分离操作时长乳胶管的另一端用牙齿咬紧，如用短乳胶管则用手指压紧，用以控制吸取动作。将稀释的水样，置浅凹载玻片上，在显微镜下观察挑取要分离的藻类细胞，吸取时把微吸管对准藻细胞，然后牙齿或手指放松，由于气流的关系，藻细胞被微吸管吸入，接着吸入的水滴放入另一凹玻片上，观察是否是目标单胞藻。然后把分离出的藻细胞移入预先装有培养液的试管中，管口塞棉塞，在适宜光照下培养。每天摇动一次。二、藻种的分离（三）分离方法2、水滴分离法将微吸管插入水样中约2cm深，提取微吸管，待无水滴自然滴下，把微吸管与载玻片接触，即有一小水滴水样留在载玻片上。按照上述方法，吸取水滴3-4滴，水滴作直线排列，相互间隔一段距离。然后在显微镜下观察每个水滴，如果某一水滴中藻细胞只有一个需要分离的藻细胞，即用培养把水滴连同藻类细胞冲入试管中，并加入培养液到试管容量的1/4，试管口塞上棉花塞，放在适宜光照下培养，每天摇动一次。3、平板划线法方法同光合细菌；由于单细胞藻类大多不适合在固体培养基中生长，因此分离效果较差。CompanyLogo单细胞藻类的培养方式（一）纯培养与单种培养：纯培养：即无菌培养，指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。单种培养：在生产性培养中是不排除细菌存在的，为了区别而称单种培养。（二）开放式培养和封闭式培养1、开放式培养把藻类培养在敞开的广口玻璃瓶，水族箱等容器中进行培养，设备简单，为目前主要的培养单细胞藻类的形式。特点：充足的光照和通风，繁殖迅速。容易受敌害生物的污染。2、封闭式培养在封闭容器中进行培养，仅有充气管，培养液加入管和藻液抽出管与外界有接触，其余不与外界接触。特点：减少敌害生物污染，成功率高。生长速度较慢。1、一次性培养在各种容器中，配制培养液，把少量藻种接种进去，在适宜的环境条件下培养，经过一段时间藻种繁殖达到较高的密度，一次全部收获。2、半连续培养半连续培养是在一次性培养的基础上，当培养的藻细胞达到或接近收获的密度时，每天收获藻液的一部分并补充等量的培养液，继续培养。3、连续培养一般为室内，人工光源，自动控温，封闭式充气培养。连续培养能使藻细胞生长繁殖的条件稳定，藻细胞始终处于指数生长期，生长迅速，产量高。CompanyLogo三、培养方法：（一）培养容器：三角烧瓶、玻璃钢水槽、水泥池等均可作为单胞藻的培养容器。（二）容器工具的消毒：同光合细菌的消毒方法。（三）培养液的制备：选择合适的培养液配方，按照配方配制。（四）接种1、接种质量一般要求选取无敌害生物污染，生活力强，生活旺盛的藻种培养。颜色正常，无大量沉淀和无明显附壁现象。2、藻种数量藻种培养：藻液容量和新配培养液比例为1：2-1：3，一般一瓶藻种可接成3-4瓶。中继培养和生产性大量培养由于培养容器容量大，藻种供应有时不足，可根据具体情况灵活掌握，但最少不宜低于1：50。一般以1：10-1：20较适宜。3、接种时间上午8-10时，不宜在晚上。（五）培养1、日常管理①搅拌和充气：通过搅拌或充气增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，补充由于藻细胞作用对二氧化碳的消耗。帮助沉淀藻细胞上浮而获得光照。防止水表面长出菌膜。搅动、摇动一般每天至少3次，定时进行，每次半分钟。充气。可24小时连续充气或间歇充气。（五）培养1、日常管理②调节光照：人工光照自然光：极端易变是太阳光源的特点，必须根据天气情况，不断调节光照度。室内尽可能利用近窗口的漫射光，防止直射光照射，光照过强时可用竹帘或布帘遮光调节。室外一般应有棚室顶架，用活动白帆布或彩条布蓬调节光照，阴雨天，可短期利用人工光照。（五）培养1、日常管理③调节温度：常温下单胞藻培养无需控温设备，冬季培养应加取暖设备来提高温度。④注意酸碱变化：CO2被吸收利用，导致藻液pH上升。其他营养物质的吸收，也会引起pH的上升或下降。如pH过高或过低，可用1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节。CompanyLogo2、培养藻类生长情况观察和检查藻类的生长情况，可通过藻液呈现的颜色，藻细胞的运动或是悬浮情况，是否有沉淀和附壁现象；菌膜和敌害生物污染迹象的有无等观察了解大概情况。（六）防治敌害生物的措施1、预防措施①严格防止污染防止污染的重点应该放在生产性藻种培养这一级上。藻种培养在室内，培养容器为玻璃瓶。防止污染条件较好。只要藻种级没有敌害生物污染，扩大培养到水池，生产周期短，就是发生污染敌害生物还需要一段生长、繁殖时间才能达到一定数量，所以影响不大。（六）防治敌害生物的措施1、预防措施②保持培养藻液的生长优势和数量优势首先接种的藻种最好取自指数生长期。接种量大，从培养开始培养藻液在培养液中即占数量上的绝对优势。③做好藻种的分离、培养和供应工作在培养过程中，严格防止污染是重要的，但从目前单细胞藻类的培养水平看，绝对防止敌害生物污染是不可能的，要根本的解决这个问题，就必须不断的补充新的“纯”藻种来取代在长期培养过程中已经受污染的藻种，这才可能使培养较好的顺利进行。清除、抑制或杀灭敌害生物的方法①使用过滤方法清除大型敌害生物饵料微藻都很小，对污染的大型敌害生物（如轮虫等）可用密筛绢网过滤方法清除。②使用药物抑制或杀灭敌害生物：如果在藻液中细菌大量繁殖时，致使藻细胞生长缓慢大量下沉，在lL藻液中加入少量青霉素，可抑制细菌的生长。③改变环境条件杀灭敌害生物利用亚心形扁藻耐高盐的特性在被污染的藻液中加入食盐也可利用其耐酸特性将pH值先降低到3，酸化0.5-1h，即可将尖鼻虫、游仆虫等敌害生物杀死。后用氢氧化钠将藻液恢复原pH，藻液经23-25h后，就可恢复游动及正常生长繁殖。清除、抑制或杀灭敌害生物的方法③改变环境条件杀灭敌害生物利用亚心形扁藻耐高盐的特性，使用提高比重的方法杀灭敌害生物。在被污染的藻液中加入食盐，把藻液比重提高到1.056-1.060，游仆虫等敌害生物可被杀死。盐藻培养受变形虫危害时，在1000ml藻液中加盐70-110g能杀死尖鼻虫，游仆虫及个体较小的原生动物。当亚心形扁藻、湛江等鞭藻中有尖鼻虫、游仆虫等敌害生物时，可以采用盐酸酸化藻液的办法进行杀灭。方法：1000ml藻液中加1mol/L盐酸3ml，边加边搅拌同时测定pH值，待pH降到3时，停止加盐酸，酸化0.5-1h，即可将上述敌害生物杀死。然后用氢氧化钠将藻液恢复原pH，藻液经23-25h后，就可恢复游动及正常生长繁殖。四、藻种的保存（一）琼脂斜面保存在微藻培养液中，溶入琼脂，制成1.5%-2%的琼脂斜面固体培养基，划线接种上微藻，在弱光下培养，当目测到藻落形成时，在实验室温下保存或放入冰箱中保存。优点时间长，一般为1年左右；如果每天让藻种接受短时间弱光照，则可保存2-3年；体积小便于携带和邮寄。琼脂斜面易干燥收缩，引起藻细胞变形，重接种时需较长时间恢复。缺点（二）液体保种1、减少接种量

如中肋骨条藻接种1周就能达到最大生长密度，然后渐渐开始衰败，2周作用就会全部死亡。必须每周或者10d左右就更新接种一次。如果在100ml的培养液中，只接种2-3滴藻种在室温和室内自然光照下，需要1个多月才能达到