《cDNA文库构建》课件

cDNA文库的构建

主要内容一、基因文库的概念及意义文库〔library〕：指一种全体的集合。基因文库〔genelibrary〕:是某一生物类型全部基因的集合，这些基因以克隆的形式存在〔人工构建〕。基因文库与基因库〔genebank〕区别基因文库与基因克隆基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。构建基因文库的意义☆使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来;☆是一种别离克隆目的基因的主要途径；☆基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。根据基因类型〔重组DNA片段的供体〕基因组文库和cDNA文库1、基因组文库构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因〔核酸探针法、免疫结合法〕基因文库限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大〔单拷贝基因、长片段基因〕筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况基因组物理图谱的构建基因组序列分析基因在染色体上的定位克隆鉴定基因调控元件基因组中基因的结构和组织形式分析基因组DNA文库应用结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA2、cDNA文库cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA(简称cDNA)。cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRAN的文库cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA自20世纪70年代中期首例

cDNA

克隆问世以来，构建

cDNA

文库已成为研究功能基因组学的根本手段之一。cDNA

便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从

cDNA

文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。通过构建

cDNA

表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于别离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA

在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

cDNA文库优点(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可别离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。(5)cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。cDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从cDNA文库中筛选到所需目的基因，并用于该目的基因的表达。一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选定组织中所有mRNA互补的DNA分子〔complementaryDNA，cDNA〕。信息量远小于基因组文库注意(1)细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于别离差异表达的基因。(3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的局部重叠的cDNA克隆。3、cDNA文库和基因组文库的区别

时效性cDNA文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN，是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因，序列组成不同cDNA文库无间隔序列和调控区等非编码区；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一局部或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。两种文库均有应用，如何选择根据试验目的，在别离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、别离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。亚克隆文库将人工染色体文库或粘粒文库中克隆的大片段DNA用鸟枪法〔shotgun〕随机小片段化，然后用这些随机小片段建立的DNA文库二、cDNA基因文库的类型

依据起始mRNA是否经过标准化预处理：非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库文库功能：克隆文库和表达文库载体类型：质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体文库根据文库构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为普通cDNA文库和全长cDNA文库依据第一链反转录引物不同分为随机引物cDNA文库和Oligod(T)cDNA文库〔一〕非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库依据起始mRNA是否经过标准化预处理，可将文库分为非标准化cDNA文库(unnormalizedcDNAlibrary)和标准化cDNA文库(normalizedcDNAlibrary);前者反映了组织中所有基因的表达水平，适于基因表达谱分析，但文库中冗余较高，发现新基因效率低。后者往往经过杂交〔均一化〕、扣除杂交(subtractivehybridization)、抑制性扣除杂交(suppressionsubtractivehybridization)处理，不能反映建库材料的基因表达情况，不能用于表达谱构建，但是新基因发现效率提高了。在研究基因功能和表达调控时，建立减法文库是一个很好的策略。它是通过野生行DNA和缺失型DNA，或不同时空、不同环境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余的DNA或CDNA片段进行克隆而构建的文库。〔二〕根据文库的功能分：克隆文库和表达文库〔1〕克隆文库由克隆载体构建，载体具有复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。克隆基因主要利用核酸探针，可用蛋白质序列或同源序列。〔2〕表达文库由表达载体构建，载体除具有克隆载体的元件外，还具有控制基因表达的序列，如启动子、SD序列、ATG、终止子等，可在宿主细胞内表达出克隆片段的编码序列，它可分为融合蛋白表达载体和天然蛋白表达载体。别离基因时，由于克隆片段的基因表达产物蛋白质具有抗原性和生物活性，所以除核酸探针外，还可用免疫学探针和生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因别离。〔三〕不同载体文库主要有质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体四大类，每类中由有许多不同的载体，不同的载体适于构建不同的基因文库。质粒文库噬菌体文库粘粒文库人工染色体文库构建文库的载体1.λ噬菌体载体根底：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。重组筛选：插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。置换载体—Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“填充片段〞gam和red基因座丧失引起的。供体DNA的大小：插入载体：0-10kbp;置换载体：9-23kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105％所限制。主要应用：插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。置换载体:基因组DNA克隆。2.粘粒(cosmid)载体根底：包含λ噬菌体cos位点的质粒；导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞；载体筛选：类似于质粒重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选；供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组75-105％所限制。主要应用：基因组文库构建。3.质粒载体构建cDNA文库4.大容量克隆载体(1)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosomes,BACs,fosmids)根底：大肠杆菌F质粒导入宿主：电转化载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：>300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。(2)P1载体和P1人工染色体(P1artificialchromosomes,PACs)根底：噬菌体P1导入宿主：体外包装和转导载体筛选：显性选择标记重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选供体DNA大小：约100kbp主要应用：大基因组分析评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。(3)酵母人工染色体(yeastartificialchromsomes,YACs)根底：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS导入宿主：转化酵母原生质体载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复)重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：>2000kbp主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。随机引物cDNA文库和Oligod(T)cDNA文库三、几种cDNA文库的介绍经典cDNA文库全长cDNA文库均一化cDNA文库差减cDNA文库(SubtractivecDNAlibrary)全长差减均一化cDNA文库

固相cDNA文库构建〔一〕经典cDNA文库构建的根本原理用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其根本步骤包括：〔1〕RNA的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。〔2〕合成cDNA在获得高质量的mRNA后，用反转录酶Oligo(dT)引导下合成cDNA第1链，cDNA第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I，同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反响)，〔3〕合成接头的参加、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断，扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ噬菌体，这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。高质量mRNA的制备反转录生成cDNA与噬菌粒载体分子相连接噬菌粒的包装cDNA噬菌粒文库的主要步骤：1、高质量mRNA的制备用试剂盒提取总RNA参加与生物素相连的寡聚(dT)引物温育参加与微磁球相连的抗生物素蛋白用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA洗脱得到mRNA2、反转录生成cDNA以寡聚dT或随机6核苷酸为引物反转录酶cDNA第一链以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链加接头准备与载体连接为了得到有方向性的cDNA应该接上不同的接头参加带有酶切位点的寡聚dT引物高活性的反转录酶合成cDNA的第一链合成cDNA第二链用RNaseH分解RNA链加EcoRI接头用XhoI内切酶切割得到双接头有方向性的cDNA(5'C↓TCGAG)3、与噬菌体载体分子相连接带有接头的cDNA噬菌粒DNA经内切酶切割含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA4、噬菌粒的包装含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA体外蛋白质外壳的包装反响有侵染和复制能力的成熟噬菌体进行基因组学的研究含有某种组织或器官的噬菌粒文库经典cDNA文库优缺点经典cDNA文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。〔二〕全长cDNA文库构建的原理为了克隆到真正的cDNA全长，建立富含全长的cDNA文库具有重要意义。为此，必须克服仅用mRNA的Poly〔A〕尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA文库，是指从生物体内一套完整的mRNA分子经反转录而得到的DNA分子群体，是mRNA分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA文库不仅能提供完整的mRNA信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。基因重组反转录酶mRNAcDNAcDNA文库的组建：反转录引物和反转录酶为了防止oligo(dT)作为cDNA第一链合成的引物造成的cDNA短截现象，人们对第一链引物末端的两个碱基作了改进(dT)nVN，其中V可以是A,C或G,N那么为A.T.C,G中的任意一种碱基，这就防止了由于mRNA内部存在寡聚(T)而造成的cDNA对应于mRNA的3’端出现的短截现象。传统的逆转录酶AMV和MMLV等都不能逆转录出很长的cDNA.SuperscriptIITM(GibcoBRL)的推出，使逆转录出更长的cDNA成为可能。(Camincieta1.,2000)研究说明一些糖类如海藻糖能有效提高反转录酶和其它一些酶类的活性，并能提高酶的最适反响温度，从而为打破mRNA的二级结构，提高反转录的效率提供了可能。5’端帽子结构真核生物的mRNA与原核生物不同，其5’端有一个特殊的甲基化帽子结构，5’端帽子结构就成为人们构建全长cDNA文库，寻找突破口的主要目标。全长cDNA文库的构建方法都是基于5'端帽子结构的特殊性研究出来的。其中代表性的方法有:Oligo-capping(Suzukieta1.,1997;Marugamaeta1.,1994),CAPture法(Ederyeta1.,1995),SMARTTM法(Y.Yeta1.,2001),CAP-Trapper法(Carnincieta1.,1996),Capselect(Schmidteta1.,1999)Oligo-capping此方法又叫做寡聚核糖核酸单链连接法(SSLLM)(Single-StrandLinkerLigationMethod/SSLLM).1994年，Maruyama等人首先取得了突破。他们利用5’帽子的结构特点，用细菌碱性磷酸酶(BAP)去除无5’端mG保护的、局部降解的、不完整mRNA末端的游离磷酸基团，再用烟草酸性磷酸酶(TAP)去除5’的mG结构仅保存一个5'P，合成一段寡核糖核酸，用T4RNA连接酶连接到经过处理的mRNAS’端的5'P上，然后利用修饰的oligo(dT)作逆转录，并进行PCR反响，称为oligocapping。CAPture法Ederly等(1995)报道了一种称为CAPture的方法，据称能够非常有效地建立全长的。DNA文库。他们利用“帽结合蛋白〞专门结合mRNA的帽结构，含有完整帽子结构的mRNA被富集，逆转录后用RNase作用于mRNA/DNA杂合子，未被帽结合蛋白结合的‘局部降解〞的不完整mRNA，有一些虽结合了“帽结合蛋白〞但DNA并不完整的mRNA都被降解，仅完整mRNA又有全长cDNA第一链结合保护的那些mRNA被保护，进一步纯化富集后建库，获得的克隆全长比例很高，但每次需极其大量的mRNA(1OOug)，另外，被帽结合蛋白结合的mRNA5'端约10-50bp被丧失。所以严格来讲所谓的全长cDNA文库并不是全长的。

SMART法

SMART法(SwitchingMechanismat5‘EndofRNATranscriptSMART)CLONTECH公司推出的试剂盒CapFinder(现又命名为SMARTTM〕是利用帽子结构特征。SMART法充分利用了反转录酶PowerscriptTMRT末端转移酶活性和限制性内切酶sfiⅠ的特性。PowerscriptTMRT是MMLU反转录酶经过点突变而得来的，它丧失了RNaseH活性，但仍然保存着野生型的聚合酶活性，并且具有较好长距离反转录能力，另外它还具有在双链核酸的3’端添加oligo(dC)的末端转移酶活性。实验设计时，在合成第一链cDNA的oligo(dT)引物的5'端加上了Sfil(A)的识别位点。当反转录到达mRNA的5'端时，借助PowerscriptTMRT的末端转移酶活性，可以在全长的cDNA末端加上几个(dC)，而截短的cDNA，由于反转录延伸没有到达mRNA的5'端，PowerscriptTMRT不能以它为底物在截短的cDNA末端加上oligo(dC)，所以在合成第二链时，带有sfiⅠ(B)的oligo(dG)引物不能与它结合，不能合成第二链，因此，理论上所得到的dsDNA都是全长cDNA。全长dscDNA在经限制性内切酶Sfil切割，由于两端的粘性末端不同，所以可以实现对目的基因的定向克隆。该方法的优点在于不存在对mRNA进行处理的酶促反响，不仅操作简单，而且一定程度上提供了全长cDNA合成的可能性。但是，该方法也存在以下缺乏:a.理论上，只有当反转录第一链cDNA到达模板mRNA的5'末端帽子结构时，末端转移酶活性才能发生，但实际上，在反转录并未到达帽子结构就终止的第一链cDNA的末端，反转录酶末端转移酶的活性照样表达，因此，文库中会有一定数量的非全长克隆，不利于以后的分析研究。b.末端转移酶活性低，加dC量小，从而导致在CapSwitch这一步中，寡核昔酸作为模板的效率不高，导致克隆的丧失。CAP-Trapper法CAP-Trapper法该方法首先由Carninci(1996)等报道。CAP-Trapper法合成全长的原理是:依据mRNA的5’端和3’端存在的二醇结构来开展工作。首先将二醇结构进行氧化，在进行生物素修饰之后经过沉淀、酒精洗涤、无RNase的灭菌水重新悬浮等筛选步骤，得到生物素化的mRNA经逆转录酶催化进行cDNA第一链的合成，接着进行RNase1处理，未被cDNA保护的mRNA(包括非全长cDNA与RNA杂交体中暴露的mRNA5'端及所有的未被cDNA保护的mRNA)即被降解。经链青霉素磁珠吸附并使用弱碱降解mRNA，如此得到单链cDNA，在末端转移酶的作用下进行5’端Oligod(G)加尾，之后再进行第二链的合成，连接载体即可得到全长cDNA文库。这种方法后来又进行了许多改进。Capselect法Capselect法防止了模板转移的要求，开发了SuperscriptII反转录酶在锰离子存在下具有很高的末端转移酶活性，然后利用此活性和rATP将一段controlled核昔酸尾巴连接到第一链cDNA末端，然后通过T4连接酶将adaptor连接上，起始第二链的合成，从而进行以后的步骤进行建库。优点:a由于开发了末端转移酶的活性，使加dC的数目增加，同时又防止了模板转移的要求，所以效率大大增加。b.需要的起始材料很少。c.处理mRNA的过程较少，这在一定程度上减少了mRNA降解的风险。d.简单，易行。缺点:无法剔除cDNA混合样中非全长cDNA。

〔三〕均一化cDNA文库它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。优点均一化cDNA文库具有以下4方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验本钱。第二，增加克隆低丰度mRNA的时机，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与均一化的cDNA文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了mRNA丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。〔四〕差减cDNA文库(SubtractivecDNAlibrary)差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同处理细胞系或植物的近等基因系等)提取mRNA(或反转录后合成cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子(Driver)与含有目的基因的试验方(Tester)进行杂交，选择性的去除两局部共同基因杂交形成的复合物，往往进行屡次的杂交—去除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交局部收集后，并连接到载体形成文库。方法提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别4碱基的限制性内切酶切割实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头进行2轮差减杂交和抑制性PCR获得富集的目的基因2.抑制性差减杂交(SSH)抑制性差减杂交(SSH)流程图检测组(Tester)—含目的基因cDNA，加接头驱逐组(Driver)—不含目的基因cDNA，不加接头

*接头含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)

易感者特异表达或高表达基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)

不易感者特异表达或高表达基因

2.抑制性差减杂交(SSH)

评价优点采用两次差减杂交和两次PCR，保证了高特异性(假阳性率可降至6％);在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，从而获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前别离新基因的主要方法缺点起始材料需要g级量mRNA;SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度2.抑制性差减杂交(SSH)SSH应用HighWire/Abstract/Title:SuppressionSubtractiveHybridization，SSH〔截止2004年9月20日〕671篇1996.01.01—12.311篇1997.01.01—12.318篇1998.01.01—12.3123篇1999.01.01—12.3148篇2000.01.01—12.3165篇2001.01.01—12.31120篇2002.01.01—12.31126篇2003.01.01—12.31156篇2004.01.01—09.20117篇2005?篇合计?篇2.抑制性差减杂交(SSH)〔五〕全长差减均一化cDNA文库全长均一化/差减cDNA文库(mRNAnomalizationandsubtractionoffull-lengthcDNAlibrary)最早由Carninci(2000)等人提出的，整个文库构建过程可分为三个步骤:第一步，全长cDNA的获得。这一阶段的方法与cap-trapper法相同。第二步，均一化/差减杂交。用上步得到的全长单链cDNA作为tester与用生物素标记的过量的drivermRNA杂交，用磁珠别离法将高表达的cDNA除去，最终得到稀有表达的单链cDNA(sscDNA)。第三步，第二链的合成和文库构建(方法同cap-trpper法)。以第一链为模板，合成dscDNA，然后经酶切，连接，包装，转染，得到全长差减的一化处理的cDNA文库。Carninci(2000)等用这种方法构建了多个全长cDNA文库，全长基因的比例到达了95%以上。CarninciP,ShibataY,HayastuN,etal.Normalizationandsubtractionofcap-trapper-selectedcDNAstopreparefull-lengthcDNAlibrariesforrapiddiscoveryofnewgenes[J].GenomeResearch,2000，10:1617-1630.〔六〕固相cDNA文库构建固相cDNA合成法的主要优点是可以简便cDNA合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有cDNA的丧失之忧，也无其它物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级别离的步骤。总之，固相法结合了传统的cDNA合成的优点并弥补了其缺乏。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量，因此它可能会替代目前应用的cDNA文库操作方法。SwitchingMechanismAt5‘endoftheRNATranscript原理：在合成cDNA的反响中事先参加的3'末端带Oligo〔dG〕的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构〞，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个〔dC〕，SMART引物的Oligo〔dG〕与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo〔dT〕的起始引物序列，另一端有的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反响得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，利用酶的天然属性，经巧妙设计而成为，研究只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反响，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、序列钓全长cDNA〔RACE〕，和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。SMARTcDNASynthesisSMARTλTrip1Ex2Ligation〔一〕、SMARTcDNA文库构建一般程序总RNA的提取LD-PCR合成cDNA蛋白酶K酶切Sfi1酶切CHROMASPIN-400Columns层析柱分级别离cDNASfi1酶切的cDNA片段与λTrip1Ex2载体连接cDNA文库构建一般程序包装反响未扩增文库滴度的鉴定未扩增文库重组率的测定cDNA文库的扩增扩增cDNA文库滴度、库容量及重组率的鉴定基因文库的保存和利用：SMARTcDNALibraryConstructionKit1、总RNA的提取与纯化

1d2d3d4d5d6d7d

←28S←18S28S→18S→

2、cDNA

第一链的合成

取500μl的离心管，依次参加以下反响成分：总RNA1.0μlSMARTIVTMOligonucleotide1.0μlCSDIII/3′PCRPrimer1.0μlDeionizedH2o(Milli-Q-filtered)2.0μlTotalvolume5.0μl混合均匀，轻微低速离心，72℃恒温水浴2min；迅速冰浴2min；混合均匀，轻微低速离心，依次参加以下反响成分：5ХFirst-StrandBuffer2.0μlDTT1.0μldNTPMix1.0μlPowerScriptTMReverseTranscriptase1.0μlTotalvolume5.0μl混合均匀，轻微低速离心，42℃恒温水浴1hr〔如果使用水浴或热循环温浴，应参加一滴矿物油，防止水分蒸发，引起体积减少〕；迅速置于冰上终止第一链cDNA的合成反响。如果第一链cDNA混合物不立即进行PCR反响，那么应立即放在-20℃贮藏〔可以贮藏3个月〕。①、95℃预热PCR仪；②、RelationshipbetweenamountofRNAstartmaterialandoptimalnumberofthermalcyclesTotalRNA(μgPolyA+RNA(μgNumberofCycles18-2020-2222-2424-263、LD-PCR合成

cDNA第二链③取500μl的离心管，依次参加以下反响成分：2μlFirst-StrandcDNA80μlDeionizedH2o10μl10хAdvantage2PCRBuffer2μl50хdNTPMix2μl5′PCRPrimer2μlCSDIII/3′PCRPrimer2μl50хAdvantage2PolymeraseMix100μlTotalVolume④、混合均匀反响成分，轻微低速离心，如果需要注意加矿物油。⑤、PCR扩赠反响程序：95℃预变性1min，95℃15sec，68℃6min,22个循环。⑥、反响结束后，取5μlPCR产物在1.1℅琼脂糖凝胶上电泳，加0.1μg1-KbDNASizeMarkers,EB染色，检测PCR产物。⑦、把dscDNA贮藏于-20℃的条件下。3000bp→2000bp→1500bp→1200bp→1030bp→900bp→800bp→700bp→600bp→500bp→LD-PCR合成dscDNA1.0%琼脂糖凝胶电泳结果1.DNAMarkers;2.dscDNA4、蛋白酶K酶切①、取500μl离心管参加50μldscDNA〔2~3μg〕；②、参加2μl蛋白酶K〔20μg/μl〕剩余的dscDNA贮藏于-20℃的条件下，蛋白酶K抑制DNA聚合酶的活性；③、混匀离心，42℃温育20min，简单离心；④、参加50μlDeionizedH2o到离心管中；⑤、参加100μl酚：氯仿：异戊醇，轻微倒转1~2min；⑥、4℃，14000rpm,离心5min；⑦、取上清液至500μl离心管，弃下层溶液；⑧、加10μlSodiumAcetate(3M;Ph4.8)，1.3μlGlycogen(20μg/μl)；⑨、参加260μl室温95℅乙醇，立即室温条件下14000rpm离心20min；〔注意在离心前不要把离心管放在-20℃或冰浴〕⑩、小心去掉上清液，用100μl80℅乙醇洗涤沉淀；加79μlDeionizedH2O重新溶解沉淀。5、Sfi1酶切①、取500μl的离心管，依次参加以下反响成分：79μlcDNA10μl10хSfi1Buffer10μlSfi1Enzyme(20units/μl)1μl100ХBSA100μlTotalVolume②、混匀，参加2μl二甲基苯腈蓝染料，混匀；6、CHROMASPIN-400Columns层析柱分级别离cDNA①、取16支1.5ml离心管按顺序作好标记；②、取出CHROMASPIN-400Columns，颠倒柱子几次使凝胶基质重悬；③、用1000μl移液器轻轻地重悬凝胶基质，防止产生气泡，然后去掉凝胶柱底部的盖子，使凝胶缓冲液自然流尽〔3min后，如果柱中的缓冲液不能排尽，重新盖尚顶部的盖子，固定好柱子〕；④、调整好流速为1滴/40~60sec，1滴的体积大约为40μl，如果流速太慢因该重新重悬基质，并且重复上述的滴定程序，到达上述参数为止；⑤、当柱子中的贮藏缓冲液滴尽为止，轻轻地沿柱子顶部的内壁加700μl柱缓冲液直到缓冲液滴尽为止；⑥、当停止滴定15~20min后，把100μlcDNASfi1酶切液和二甲基苯腈蓝混合液参加到层析柱中，进行分级别离〔样品要充分被基质吸附〕，用100μl的层析柱缓冲液来洗含有cDNA片段的层析柱，使液滴流尽为止；⑦、然后取标记好的离心管，放在层析柱下，加600μl层析柱缓冲液，开始收集液滴，大约每管35μl，直到16支管收完为止；⑧、检测分级别离效果，从每个管中取3μl收集液，在1.1℅琼脂糖凝胶上电泳，检测所收集的cDNA片段范围，以确定所需的收集液；⑨、把所需dscDNA大于0.5Kb以上的8~12号管收集液倒在一起，然后加1/10体积的SodiumAcetate(3M;Ph4.8)，1.3μlGlycogen(20μg/μl)，2.5倍体积95℅乙醇〔-20℃〕，充分混匀，前后倒置摇动。⑩、然后放在-40℃沉淀过夜；室温，14000rpm离心20min；去掉上清液，室温枯燥沉淀10min；用7μlDeionizedH2o溶解沉淀，经Sfi1酶切的cDNA片段便可以用来进行连接反响。7、Sfi1酶切的cDNA片段与λTrip1Ex2载体连接8、包装反响①、取50μl包装提取物〔EpicentrecomponyMaxplaxTMPackagingExtract〕室温融化；②、取出25μl参加含5μl连接产物的1.5ml离心管中，剩余暂放于-70℃冰箱；③、轻轻混匀，防止产生气泡，轻微离心，使溶液收集于管低；④、30℃水浴，90min；⑤、反响结束后，再参加25μl包装提取物，在30℃水浴，90min⑥、包装反响结束后，加600μlphagedilutionbuffer，轻轻混匀离心；⑦、加25μl氯仿，轻轻混匀离心，放4℃贮藏〔可以放2周〕；⑧、共获得680μl未扩增文库。9、未扩增文库滴度的鉴定①、制备90mmLB/MgSO4/Tet固体平板6个，37℃预热和枯燥1hr；②、取40μl未扩增文库参加360μl1хLambdadilutionbuffer〔1：10稀释〕；③、分别取上述稀释后文库1μl、10μl的包装混合物同200μl过夜培养的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包装后的噬菌体吸附细菌20min；④、反响结束后，加3ml融化的LB/MgSO4顶层培养基混匀后迅速倒入LB平板上铺平，室温冷却10min让底层LB平板巩固；⑤、倒置平板，37℃过夜培养15hr，计算噬菌斑数目。⑥、稀释后文库1μl平均噬菌斑数目为29个，10μl平均噬菌斑数目310个；未扩增文库的滴度〔pfu/ml〕=(2.9+3.1)х10х1000μl/ml2х1μl=3.0х105pfu/ml原始cDNA文库滴度和重组率的鉴定插入cDNA片段大小分析

M1234567891011

M1213141516171819202122图4-4重组质粒DNA的SfiI酶切电泳结果M：DNAMarkers;1-22:重组质粒2000bp→1500bp1000bp700bp400bp200bp123456789101112131415161718

图2-4重组质粒的PCR检测电泳结果泳道9：DNAMarkers;泳道1-8,泳道10-18:重组质粒

未扩增文库重组率的测定

①、制备100mmLB/MgSO4/Tet固体平板2个，37℃预热和枯燥1hr；②、取40μl未扩增文库参加360μl1хLambdadilutionbuffer〔1：10稀释〕；③、取上述稀释后文库100μl的包装混合物参加200μl过夜培养的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包装后的噬菌体吸附细菌20min；④、反响结束后分别参加50μlIPTG〔100mM〕、50μlX-Gal〔100mM〕混匀后加3ml融化的LB/MgSO4顶层培养基混匀后迅速倒入LB平板上铺平，室温冷却10min让底层LB平板巩固；⑤、倒置平板，37℃过夜培养15hr，计算蓝、白斑噬菌斑数目；⑥、两个LB平板的蓝、白斑分别为4个蓝斑、720个白斑；31个蓝斑、379个白斑；未扩增文库的重组率=1099(白斑)1134(总噬菌斑)=96.9%cDNA文库的扩增

①、制备15个150mmLB/MgSO4/Tet固体平板；②、挑一个别离良好的XL1–Blue单菌落接种到15mlLB/MgSO4/Maltose液体培养基上，140rpm，37℃培养过夜直至OD600=2.0，在4℃，5000rpm离心5min，用7.5mlMgSO4〔10mM〕重悬沉淀菌液；③、取未扩增文库38μl的包装混合物参加500μl过夜培养的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包装后的噬菌体吸附细菌20min；④、反响结束后，加5ml融化的LB/MgSO4顶层培养基混匀后迅速倒入LB平板上铺平，室温冷却10min让底层LB平板巩固；倒置平板，37℃过夜培养15hr，直至噬菌斑相互接触；⑤、每一平板加12ml1хLambdadilutionbuffer，在4℃过夜培养；室温下50rpm振荡培养1hr；⑥、收集噬菌体裂解液于500ml烧杯中，参加10ml氯仿溶液，旋涡振荡2min，7000rpm，离心5rpm；收集上清液，此时获得一个扩增的cDNA文库。扩增cDNA文库滴度、库容量及重组率的鉴定①、制备100mmLB/MgSO4/Tet固体平板1个，37℃预热和枯燥1hr；②、取10μl扩增cDNA文库参加990μl1хLambdadilutionbuffer〔1：100稀释〕；③、取10μl上述稀释后的扩增cDNA文库参加200μl过夜培养的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包装后的噬菌体吸附细菌20min；④、反响结束后分别参加50μlIPTG〔100mM〕、50μlX-Gal〔100mM〕混匀后加3ml融化的LB/MgSO4顶层培养基混匀后迅速倒入LB平板上铺平，室温冷却10min让底层LB平板巩固；⑤、倒置平板，37℃过夜培养15hr，计算蓝、白斑噬菌斑数目；⑥、扩增cDNA文库的滴度〔pfu/ml〕=196х100х1000μl/ml10μl=1.96х106pfu/mlcDNA文库扩增后的总体积为160ml，因此，扩增cDNA文库的容量为3.136х108pfu；扩增文库的重组率=1848(白斑)1900(总噬菌斑)=97.3%⑦、扩增cDNA文库的长期保存：把扩增cDNA文库分装成每份1ml，参加DMSO终浓度为7%，放-70℃长期保存。重组质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果

重组质粒DNA的SfiI酶切电泳结果

〔二〕cDNA文库的质量评价代表性序列完整性其他cDNA文库的质量评价文库的代表性cDNA文库的代表性是指文库中包含的重组cDNA是否能完整地反映出来源细胞中表达的全部信息〔即mRNA种类〕，它是表达文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用一个量化的指标来衡量，即文库的库容量，它是指构建的原始cDNA文库中所包含的独立的重组子克隆数。具备完好代表性的cDNA文库所需的库容量取决于来源细胞中表达的基因的总复杂度，具体来讲就是来源细胞中的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数满足实验最低要求的cDNA文库的库容量可用以下公式：N=ln(1-p)/ln(1-n/T)其中P为文库中包含细胞中任何一种mRNA序列信息的概率，通常设为99%；N为文库中以概率P出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数；n为细胞中最稀少的mRNA序列的拷贝数；T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数。以人类细胞为例，人类基因组携带的遗传基因总数约为3-4万个，而某一特定类型的细胞中，表达出的基因种类仅占基因组全部基因的15%。因此，对于绝大局部的人类细胞，每个细胞内具体表达的mRNA种类约为15000种，全体mRNA序列的总拷贝数约为5000000个，而细胞中最稀有的mRNA种类的拷贝数平均为8个。因此，用人类细胞来构建cDNA文库时，要以99%的概率保证文库中包含有细胞表达出的任何一种mRNA的序列信息，构建出的原始cDNA文库理论上应具有的最少独立克隆数为2.9×105。但在实际工作中，由于在cDNA文库构建过程中存在多种操作误差和系统误差，一个具有完好代表性的cDNA文库至少应具有106以上的库容量。2、重组cDNA片段的序列完整性构建的cDNA文库中，重组cDNA片段的序列完整性也是反映文库质量的一个重要因素。在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体的序列不同，但根本上都是由三个局部组成，即5’端非翻译区〔5’UTR〕、中间的编码序列和3’端非翻译区〔3’UTR〕。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用。编码序列那么是合成基因产物—蛋白质的模板。对于大多数真核基因，其编码的蛋白质产物在结构上都具有相对独立的结构域，存在于同一分子上的结构域对表达出蛋白产物在细胞中所行使的生物学功能是必需的。这些结构域在基因的编码区上也有对应的编码序列。因此，要从文库中别离获得的目的基因完整的序列信息和功能信息，要求文库中的重组cDNA片段应尽可能完整地反映出原始基因的结构。基于此，目前不少研究者在构建cDNA文库时，都十分注重全长cDNA克隆的重要性。但在实际研究中，cDNA文库中重组的cDNA片段是否为全长，对文库使用价值的影响并不是绝对的，如大多数真核mRNA的5’端非翻译区都含有与编码区处于同一阅读框的终止密码子，这些序列的存在会严重影响克隆的全长cDNA序列在宿主细胞中的表达，从而在目的基因的别离鉴定中，限制了一些极有价值的筛选方法的使用。此外，一些较长序列的基因，其全长cDNA片段可能会超出克隆载体的装载容量，影响得组子在宿主细胞中的复制，这局部克隆在文库扩增过程中很容易丧失，从而影响文库的代表性。因此，在实际工作中，如何使用文库中cDNA序列完整性这一指标，应按研究者自己的研究目的及具体采用的筛选方法来录活考虑，并无固定的模式。在细胞中表达出的各种mRNA片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体序列不同，但根本上都是由3局部组成，即5'端非翻译区，中间的编码区和3'端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列那么是合成基因产物—蛋白质模板。因此，要从文库中别离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组cDNA片段足够长以便尽可能地反响出天然基因的结构。5'端：如果有同源全长基因的比较，可以通过与其它生物的对应基因5'末端进行比较来判断。如果无同源基因的新基因，那么首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个ATG上游有无同框架的终止密码子；其次，判断是否有转录起始点，一般加在5'帽结构后有一段富含嘧啶的区域，或者是cDNA5'序列与基因组序列中经过酶切保护的局部相同，那么可以确定得到的cDNA的5'端是完整的。3'端：同样可以用其它生物的对应基因3'末端进行比较来判断，或编码框架的下游有终止密码子，或有1个以上的PolyA加尾信号，或无明显加尾信号的那么也有PolyA尾。其它标准基因文库的质量标准

除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备以下条件：

重组克隆的总数不宜过大

以减轻筛选工作的压力

载体的装