维生素类药物的分析

关于维生素类药物的分析

公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来的维A。

1600年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。

1747年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C。

1831年-胡萝卜素被发现。

1911年-波兰化学家丰克为维生素命名。

1915年-科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的维生素发展史第2页,共149页，2024年2月25日，星期天1916年-维生素B被分离出来。

1917年-英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病，随后断定这种病是缺乏维D引起的。

1920年-发现人体可将胡萝卜素转化为维生素A

1922年-维E被发现。

1928年-科学家发现维B至少有两种类型。

1933年-维E首次用于治疗。

1948年-大剂量维C用于治疗炎症。

第3页,共149页，2024年2月25日，星期天1949年-维B3与维C用于治疗精神分裂症。

1954年-自由基与人体老化的关系被揭开。

1957年-Q10多酶被发现。

1969年-体内超级抗氧化酶被发现。

1970年-维C被用于治疗感冒。

1993年-哈佛大学发表维生素E与心脏病关系的研究结果。第4页,共149页，2024年2月25日，星期天VitA、D2、D3、E、K1

等脂溶性水溶性VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、泛酸等。分类按溶解度分第5页,共149页，2024年2月25日，星期天第一节维生素A的分析分类：A1、A2、A3A1存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又称为视黄醇,天然维生素A主要以此形式存在。脂溶性淡黄色片状结晶，熔点64℃。A2主要存在于淡水鱼的肝脏中。维生素A2的化学结构与A1的区别只是在β-白芷酮环的3,4位上多一个双键。第6页,共149页，2024年2月25日，星期天功能：维持视觉：维生素A可促进视觉细胞内感光色素的形成。维生素A可调试眼睛适应外界光线的强弱的能力，以降低夜盲症和视力减退的发生，维持正常的视觉反应,有助于对多种眼疾(如眼球干燥与结膜炎等)的治疗。

2.促进生长发育：与视黄醇对基因的调控有关.视黄醇也具有相当于类固醇激素的作用，可促进糖蛋白的合成。促进生长、发育，强壮骨骼，维护头发、牙齿和牙床的健康。

第7页,共149页，2024年2月25日，星期天3.维持上皮结构的完整与健全视黄醇和视黄酸可以调控基因表达，减弱上皮细胞向鳞片状的分化，增加上皮生长因子受体的数量。保持皮肤湿润，防止皮肤黏膜干燥角质化，不易受细菌伤害，有助于对粉刺、脓包、疖疮，皮肤表面溃疡等症的治疗。4.加强免疫能力维生素A有助于维持免疫系统功能正常，能加强对传染病特别是呼吸道感染及寄生虫感染的身体抵抗力；有助于对肺气肿、甲状腺机能亢进症的治疗。第8页,共149页，2024年2月25日，星期天富含维生素A的食物梨、苹果、枇杷、樱桃、香蕉、桂圆、杏子、荔枝、西瓜、甜瓜。水果类第9页,共149页，2024年2月25日，星期天蔬菜类

马齿菜、大白菜、荠菜、番茄、茄子、南瓜、黄瓜、菠菜第10页,共149页，2024年2月25日，星期天植物类绿豆、大米、胡桃仁第11页,共149页，2024年2月25日，星期天一、结构与性质（一）结构R:-H维生素A醇

-COCH3维生素A醋酸酯

-COC15H31维生素A棕榈酸酯一个共轭多烯侧链的环己烯，有立体异构体第12页,共149页，2024年2月25日，星期天

醋酸酯

相对生物效价维生素A325.5100%新维生素Aa32875%新维生素Ab320.524%新维生素Ac310.515%异维生素Aa32321%异维生素Ab32424%第13页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）性质1、具紫外吸收：在325～328nm间有最大吸收2、不稳定性：（易氧化变质）

易被空气中氧或氧化剂氧化易被紫外光裂解在加热和金属离子存在时，更易氧化变质，生成无生物活性的环氧化物、维生素A醛及维生素A酸第14页,共149页，2024年2月25日，星期天△或有金属离子存在时氧化↑第15页,共149页，2024年2月25日，星期天3、能与三氯化锑呈色：产生不稳定的蓝色。4、溶解性：维生素A能与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶第16页,共149页，2024年2月25日，星期天二、鉴别试验（一）三氯化锑反应原理：维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中，即显蓝色，渐变成紫红色。注意：鉴别在无水、无醇（乙醇可以和碳正离子作用使其正电荷消失）条件下进行。CHCl3水中水解为氯化氧锑第17页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）紫外吸收光谱：

5个共轭双键6个共轭双健第18页,共149页，2024年2月25日，星期天去水VitA（VitA3）↓VitA第19页,共149页，2024年2月25日，星期天第20页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）薄层色谱吸附剂：硅胶G展开剂：环己烷-乙醚(80:20)点样量：各2μl，不必挥散溶剂，立即展开显色剂：三氯化锑溶液结论：比较供试品溶液和对照品溶液所显蓝色斑点位置第21页,共149页，2024年2月25日，星期天BP

杂质对照品法显色剂三氯化锑USP显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值第22页,共149页，2024年2月25日，星期天立体异构体氧化降解产物合成中间体副产物UV法（一）三、含量测定维生素A2维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸第23页,共149页，2024年2月25日，星期天1、方法建立的依据三点校正法第24页,共149页，2024年2月25日，星期天2、测定原理方法的依据：★主成分：在325～328nm有吸收★杂质：在310～340nm范围内吸收呈一条直线，且随波长的增大，吸收度变小。★物质对光的吸收具有加和性。第25页,共149页，2024年2月25日，星期天3、三点波长的选择（1）第1点：选择维生素A的最大吸收波长(λ1)（2）第2点和第3点：在λmax两侧各选一点①等波长差法：λ3-λ1=λ1-λ2

测定VA醋酸酯，规定：

λ1=328nm，入2=316nm，λ3=340nm②等吸收度法：Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1

测定VA醇，规定：

λ1=325nm，λ2=310nm,λ3=334nm第26页,共149页，2024年2月25日，星期天4、杂质吸收(1)维生素A2和维生素A3(2)维生素A的氧化产物为环氧化物、维生素A醛和维生素A酸。(3)维生素A在光照下产生的无生物活性的聚合物鲸醇。(4)维生素A的异构体。(5)合成时产生的中间体。

(1)～(5)这些杂质在310～340nm波长范围内有吸收，因此，在测定维生素A含量时，必须考虑这些杂质的干扰。三点校正法可以消除这些杂质的影响。第27页,共149页，2024年2月25日，星期天5、测定方法（1）基本步骤:第一步A的选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已被基本消除第28页,共149页，2024年2月25日，星期天第二步：求百分吸收系数，

注意：

C为混合样品的浓度第29页,共149页，2024年2月25日，星期天第三步求效价换算因数由纯品计算而得：第30页,共149页，2024年2月25日，星期天第31页,共149页，2024年2月25日，星期天第32页,共149页，2024年2月25日，星期天第四步：求标示量％第33页,共149页，2024年2月25日，星期天(2)第一法—等波长差法，高纯度VA醋酸酯测量方法：计算各波长下的吸收度与328nm波长下的吸收度的比值第34页,共149页，2024年2月25日，星期天判断是否在326～329nm之间在326～329nm之间改用第二法是否

求算并与规定值比较第35页,共149页，2024年2月25日，星期天

规定值差值第36页,共149页，2024年2月25日，星期天判断前提；最大吸收波长在326～329nm之间A的选取直接用A328A328

A328校正

第一法不适用

第37页,共149页，2024年2月25日，星期天03%－15%－3%第二法第二法第38页,共149页，2024年2月25日，星期天讨论VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或称6/7定位法）推导而来。在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。在测定前务必要校正波长。测定的样品应不得少于两份。第39页,共149页，2024年2月25日，星期天（3）第二法皂化法：适用于维生素A醇加热回流第40页,共149页，2024年2月25日，星期天判断

max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定计算是否≤0.73进一步判断＞0.73，杂质含量过高第41页,共149页，2024年2月25日，星期天03%－3%第42页,共149页，2024年2月25日，星期天二、三氯化锑比色法优点简便快速λmax618nm～620nm标准曲线法缺点呈色不稳定（5~10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性第43页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）高效液相色谱法RP-HPLC同时测定人血清中VitA和VitE的含量1、仪器与分析条件：HPLC-UV、C18(300×3.9mm）、甲醇－水（96：4）、流速：1.2ml/min、检测波长：0～8min(330nm),8min后(292nm）内标：维生素A醋酸酯第44页,共149页，2024年2月25日，星期天血清样品的制备：LLE法制备分析方法的建立：线性

LODRecoveryPrecisionChromatogram:第45页,共149页，2024年2月25日，星期天作业：维生素AD胶丸中维生素A醋酸酯的测定方法如下：取内容物0.0410g，加环己烷溶解并稀释至50ml，摇匀，取出2ml加环己烷溶解并稀释至25ml，摇匀，在下列5个波长处测定吸光度如下：已知：平均丸重（平均内容物重）=0.0910g，标示量10000IU/丸，求维生素A醋酸酯的标示量%？波长（nm）测得A值药典规定的吸收度比值3000.2120.5553160.3090.9073280.3371.0003400.2730.8113600.1160.299第46页,共149页，2024年2月25日，星期天第二节维生素Bl的分析第47页,共149页，2024年2月25日，星期天第48页,共149页，2024年2月25日，星期天二、结构及性质(一)结构氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)HClCl-存在于米糠、麦麸和酵母中人工合成第49页,共149页，2024年2月25日，星期天(二)性质（1）溶解性：在水中易溶，水溶液显酸性在乙醇中微溶，在乙醚中不溶（2）具有紫外吸收：λmax=246nm（HCl溶液）（3）硫色素反应：具有荧光第50页,共149页，2024年2月25日，星期天（4）碱性

可与酸成盐

与生物碱沉淀试剂反应，生成组成恒定的沉淀。

（5）氯化物特性嘧啶环—伯胺噻唑环—季铵碘化汞钾、三硝基酚、碘溶液、硅钨酸等第51页,共149页，2024年2月25日，星期天三、鉴别试验(一)硫色素反应——维生素B1的专属反应原理：第52页,共149页，2024年2月25日，星期天第53页,共149页，2024年2月25日，星期天硫色素【O】第54页,共149页，2024年2月25日，星期天注意事项：(1)硫色素反应为维生素Bl的专属反应，虽非定量完成，但在一定条件下形成的硫色素与维生素Bl浓度成正比，且回收恒定。故可用于维生素Bl及其制剂的含量测定。(2)本法为维生素B1所特有，故不受氧化破坏产物的干扰，测定结果较为准确。但操作繁琐，且荧光测定受多种因素干扰；(3)本法中使用的氧化剂，除铁氰化钾外、尚可用氯化汞或溴化氰。其中，溴化氰能将维生素Bl完全定量地氧化为硫色素，在较宽的浓度范围内与荧光强度成正比，且尿液中某些代谢产物不干扰测定。故亦适用于临床体液分析。第55页,共149页，2024年2月25日，星期天VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反应第56页,共149页，2024年2月25日，星期天S元素反应Cl-反应（三）其他反应()21PbSNaSVitBNO3PbNaOH第57页,共149页，2024年2月25日，星期天四、含量测定非水溶液滴定法（原料）和紫外分光光度法（制剂）、硫色素荧光法（USP（24））。（一）非水滴定法1、原理：含有两个碱性的已成盐的伯胺和季铵基团，在非水溶液中可与高氯酸作用，用于含量测定。

喹那啶红－亚甲蓝（紫红→天蓝）第58页,共149页，2024年2月25日，星期天第59页,共149页，2024年2月25日，星期天2、方法：用冰醋酸作溶剂，滴加醋酸汞，以喹哪啶红—亚甲蓝混合物作指示剂，高氯酸作滴定液第60页,共149页，2024年2月25日，星期天3、注意事项：（1）加醋酸汞。（2）滴定度为16.86mg/ml。

VB1有两个碱性基团，与高氯酸反应的摩尔比为1︰2（3）非水容量法可用于弱酸性特别是弱碱性药物及其盐类的含量测定。（4）此处仅适用于维生素B1的原料药含量测定。第61页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）紫外分光光度法1、原理：第62页,共149页，2024年2月25日，星期天2、VB1片的含量测定

测定方法：

以盐酸溶液(9→1000)作溶剂，在246nm测定吸收度，按Cl2Hl7ClN4OS·HCl的吸收系数(百分吸收系数)为421计算，即得。

第63页,共149页，2024年2月25日，星期天片剂、注射剂=421（每片）相当于标示量的%=A=ECL规格g/片g/100mlgChP第64页,共149页，2024年2月25日，星期天（每ml）相当于标示量的%=规格g/mlml第65页,共149页，2024年2月25日，星期天差示分光光度法简称ΔA法取两份相等的供试液，一份加酸，另一份加碱或缓冲液或其他能够发生某种化学反应的试剂，有时也可不加任何溶液，然后将两者分别稀释至同样浓度，一份置样品池中，另一份置参比池中，于适当波长处，测其吸收度的差值（ΔA值）在供试溶液的一定浓度范围内，ΔA值与浓度C之间呈线性关系。优点：在不同pH介质中，或经适当化学反应后，供试物发生了特征性的光谱变化，而赋形剂或其他共存物质不受pH条件或化学试剂的影响，未引起光谱变化，从而消除了它们的干扰。第66页,共149页，2024年2月25日，星期天差示分光光度法ΔA法使用：1、利用最大吸收波长进行药物的测定：紫外光谱对pH十分敏感时，可测得ΔA（碱-酸）或ΔA（pH7-酸）。2、利用最大吸收与最小吸收之差（即振幅）进行药物测定：某些药物共存物在某pH范围内的光谱与pH无关（即吸收度不变）。而主药有最大和最小吸收，两者差值与主药浓度成正比。

第67页,共149页，2024年2月25日，星期天差示分光光度法ΔA法使用：3、利用干扰杂质等吸收波长进行测定：于干扰物的等吸收波长处进行测量，如测得供试物的相应吸收度，即可消除共存物的干扰。4、利用最小吸收波长(lmin)处的增色效应进行测定：某些药物在碱性和酸性溶液中吸收重叠，但吸收值不同。但在碱性或酸性溶液中于lmax或lmin处可产生增色效应，利用此效应可测定药物浓度。

第68页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）硫色素荧光法原理1、荧光硫色素异丁醇铁氰化钾1VitBNaOH通过与对照品荧光强度的比较即可测得供试品含量第69页,共149页，2024年2月25日，星期天2、实验操作

40ml具塞试管3支→对照品溶液5ml；其中2支加入氧化试剂3.0ml，再迅速加入异丁醇20ml，振摇。第三支试管中加入3.5mol/l的NaOH，同法操作为空白。另取三支试管加入供试品，同法操作。各试管中加入无水乙醇2ml，分取异丁醇，进行荧光测定。第70页,共149页，2024年2月25日，星期天3、结果计算式中：A和S分别为供试品和对照品溶液测得的平均荧光读数；

b和d则分别为其相应的空白读数；

0.2为对照品溶液的浓度（µg/ml）；

5为测定时对照品溶液的取样体积（ml）。第71页,共149页，2024年2月25日，星期天特点4、（1）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于体液分析（3）该法适用于VitB1的制剂含量分析（4）可用BrCN为氧化剂，反应定量完全，适合于生物样本分析第72页,共149页，2024年2月25日，星期天

第三节维生素C的分析

功效：1、促进胶原蛋白的合成2、治疗坏血病3、预防牙龈萎缩、出血4、预防动脉硬化5、抗氧化剂6、治疗贫血7、防癌8、保护肝脏的解毒能力和细胞的正常代谢9、提高人体的免疫力10、提高机体的应急能力第73页,共149页，2024年2月25日，星期天维生素C有四种光学异构体，其中以L-构型右旋体的生物活性最强。

药典：维生素C原料、片剂、泡腾片、颗粒剂和注射剂第74页,共149页，2024年2月25日，星期天一、结构及性质(一)结构

具有烯二醇结构和内酯环

在C4、C5有两个手性碳原子

性质活泼

具有旋光性第75页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）性质1、溶解性：

水中易溶

乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶

水溶液呈酸性第76页,共149页，2024年2月25日，星期天C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57一元酸（与碳酸氢钠成盐）2、具有酸性第77页,共149页，2024年2月25日，星期天烯二醇结构（抗坏血酸）二酮基结构（去氢抗坏血酸）烯二醇结构[o]-2H+2H3、强还原性第78页,共149页，2024年2月25日，星期天有活性有活性无活性L-二酮古洛糖酸第79页,共149页，2024年2月25日，星期天L(+)－抗坏血酸活性最强手性C（C4、C5）**4、光学活性第80页,共149页，2024年2月25日，星期天与碱反应内酯环5、水解性第81页,共149页，2024年2月25日，星期天△糖类的显色反应50℃结构与糖类相似6、糖类的性质第82页,共149页，2024年2月25日，星期天7、紫外吸收特性第83页,共149页，2024年2月25日，星期天二、鉴别试验（一）利用VC所具有的强还原性第84页,共149页，2024年2月25日，星期天1、与硝酸银反应(1)方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取该溶液5m1，加硝酸银试液0.5m1，即生成银的黑色沉淀。(2)原理：烯二醇基，具强还原性

第85页,共149页，2024年2月25日，星期天2、与2，6—二氯靛酚反应(1)方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取该溶液5m1，加2，6—二氯靛酚试液1～2滴，试液的颜色即消失。第86页,共149页，2024年2月25日，星期天原理：氧化型玫瑰红色还原型蓝色OHˉ（玫瑰色）（无色）第87页,共149页，2024年2月25日，星期天3、与其他氧化剂反应亚甲蓝或高锰酸钾试剂褪色

碱性酒石酸铜砖红色沉淀

磷钼酸钼蓝

第88页,共149页，2024年2月25日，星期天或盐酸吡咯50℃（二）利用维生素C所具有糖类性质的反应第89页,共149页，2024年2月25日，星期天

H+吡咯第90页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）利用VC所具有的紫外吸收特性

维生素C在0.0lmol/L盐酸液中，在243nm波长处有惟一的最大吸收，利用此特征进行鉴别。

BP中采用该法，并规定其吸收系数应为545～585之间（四）薄层色谱第91页,共149页，2024年2月25日，星期天三、杂质检查1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质分光光度法2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法3.草酸的检查：

第92页,共149页，2024年2月25日，星期天四、含量测定具有较强的还原性，可被不同氧化剂定量氧化。（一）碘量法1、原理指示剂淀粉指示液第93页,共149页，2024年2月25日，星期天H+第94页,共149页，2024年2月25日，星期天

取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6方法2、第95页,共149页，2024年2月25日，星期天3、注意事项①防止样品氧化减慢VitC被O2氧化速度②用新沸冷水作溶剂赶走水中O2③应用范围广对维生素C原料、维生素C片、维生素C泡腾片、维生素C注射液、维生素C颗粒剂等的含量测定均采用。差别仅在前处理：为了消除制剂中辅料对测定的干扰，滴定前要作些必要的处理。第96页,共149页，2024年2月25日，星期天4、附加剂干扰的排除片剂——滑石粉——过滤注射剂——抗氧剂——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5第97页,共149页，2024年2月25日，星期天2，6-二氯靛酚滴定法（二）USPJP原理1、酚亚胺二氯靛酚，-62VitC第98页,共149页，2024年2月25日，星期天自身指示终点法方法2、第99页,共149页，2024年2月25日，星期天（2）快速滴定2min内

（1）酸性环境HPO3-HAc

稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定

（定量过量）（测剩余染料）讨论3、第100页,共149页，2024年2月25日，星期天（4）缺点

需经常标定贮存≤一周不稳定干扰多氧化力较强第101页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）高效液相色谱法人血浆中VitC浓度的HPLC法测定1、色谱条件2、标准溶液的制备3、血浆样品的处理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法学考察5、测定第102页,共149页，2024年2月25日，星期天第103页,共149页，2024年2月25日，星期天是抗佝偻病维生素的总称。收载有：维生素D2、D3原料药、维生素D2胶丸和注射剂、维生素D3注射剂等。第四节维生素D的分析第104页,共149页，2024年2月25日，星期天维生素D3－胆骨化醇一、结构与性质维生素D2－骨化醇24（一）结构第105页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）性质：1、性状：D2、D3无臭、无味，遇光易变质2、溶解性：在植物油中略溶，水中不溶3、不稳定性：含有多个烯键，不稳定，易氧化变质降低效价，毒性增加。4、旋光性：维生素D2有6个手性碳原子维生素D3有5个手性碳原子5、显色反应：甾醇类化合物共有6、紫外吸收特性第106页,共149页，2024年2月25日，星期天二、鉴别试验（一）显色反应1.醋酐-硫酸反应D2

黄红紫绿

D3

黄红紫、蓝绿绿2.三氯化锑反应橙红色渐变粉红3.三氯化铁反应橙黄色4.二氯丙醇和乙酰氯反应绿色渐变渐变迅即迅即第107页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）比旋度鉴别维生素D2维生素D3溶剂

浓度比旋度值无水乙醇无水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事项：应于容器开启30分钟内取样在溶液配制后30分钟内测定第108页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）区别反应：

以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸D2显红色，在570nm处有最大吸收D3显黄色，在495nm处有最大吸收4.其他方法：

TLC、HPLC、制备衍生物测熔点。

第109页,共149页，2024年2月25日，星期天三、杂质检查维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。前维生素D的光照产物第110页,共149页，2024年2月25日，星期天四、含量测定方法

中国药典采用正相高效液相色谱法(NP-HPLC）测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯。根据样品的具体情况按以下三个方法进行分析。第111页,共149页，2024年2月25日，星期天第一法：用于无维生素A醇及其它杂质干扰的情况系统适用性试验：测定重复性和分离度。固定相：硅胶

流动相：正己烷-正戊醇（997：3）照射第112页,共149页，2024年2月25日，星期天第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：

1．皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸发除乙醚、制备供试液A。

2．净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制备成供试液B。

固定相：ODS

流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2）

3．含量测定：取供试液B按第一法测定。

第113页,共149页，2024年2月25日，星期天第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况1．制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，正已烷溶解，得供试液C。

制备对照液：对照品储备液（异辛烷溶解），稀释、加热。2．含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样。对照液和供试液，按外标法定量第114页,共149页，2024年2月25日，星期天讨论1、采用的是正相高效液相色谱法2、测定过程中应避免VitD的氧化3、皂化应剧烈振摇，水浴温度≤40℃，提取溶剂大多采用己烷或戊烷以消除苯的毒性4、若供试品中没有VitA醇及其它杂质干扰时，可以直接进样分析5、注意色谱系统适用性样品VitD、前VitD的制备方法第115页,共149页，2024年2月25日，星期天一、结构及性质(一)结构维生素E为苯并二氢吡喃醇衍生物，苯环上有一个乙酰化的酚羟基，故又称生育酚醋酸酯。有α、β、γ和δ四种异构体，其中以α异构体的生理作用最强。第五节维生素E的分析第116页,共149页，2024年2月25日，星期天dl－α－生育酚醋酸酯第117页,共149页，2024年2月25日，星期天(二)性质1、溶解性

微黄色或黄色透明的粘稠液体

易溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中，不溶于水2、具有紫外吸收：苯环上有酚羟基

VE的0.lmg/ml无水乙醇溶液在284nm波长处测定吸收度时，其吸收系数为41.0～45.0。第118页,共149页，2024年2月25日，星期天3、易水解氧化：★在无氧或其他氧化剂存在时，对热稳定★在有氧或其他氧化剂存在时，遇光、空气可被氧化第119页,共149页，2024年2月25日，星期天二、鉴别试验（一）硝酸反应原理：75℃15′橙红色第120页,共149页，2024年2月25日，星期天（橙红色）生育红HNO3强氧化剂第121页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）三氯化铁反应第122页,共149页，2024年2月25日，星期天=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%无水乙醇中UV法（三）第123页,共149页，2024年2月25日，星期天薄层板硅胶G展开剂环己烷-乙醚（4：1）显色剂硫酸（105℃5′）

结果各物质的Rf值分别为：α-生育酚为0.5α-生育酚醋酸酯为0.7α-生育酮为0.9（四）TCL法第124页,共149页，2024年2月25日，星期天三、特殊杂质1、酸度目的：制备过程引入的游离醋酸

方法：以NaOH滴定液（0.1mol/L≤0.5ml）体积控制。2、游离生育酚的检查原理：利用游离生育酚的还原性，用硫酸铈滴定液(0.0lmol/L)滴定，以二苯胺为指示剂，杂质的限量为2.15%。第125页,共149页，2024年2月25日，星期天硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄→灰紫）（二）试剂第126页,共149页，2024年2月25日，星期天（M生育酚=430.8）

取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。第127页,共149页，2024年2月25日，星期天≤2.15％限量（三）第128页,共149页，2024年2月25日，星期天药典规定消耗硫酸铈液（0.01mol/L）≤1.0ml若硫酸铈液浓度不是0.01mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量第129页,共149页，2024年2月25日，星期天四、含量测定（一）GC法（法定方法）GC特点选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制第130页,共149页，2024年2月25日，星期天

中国药典（2005年版）规定：VE的原料药、片剂、注射剂、胶丸、粉剂等都采用气相色谱法。1、色谱条件与系统适用性试验载气：氮气固定相：硅酮(OV-I7)涂布于经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球上，涂布浓度为2%;第131页,共149页，2024年2月25日，星期天

柱温：265℃;进样口温度高于柱温30～50℃

检测器：氢火焰离子化检测器;

柱效：理论塔板数按维生素E峰计算应不低于500

分离度：维生素E峰与内标物质峰的分离度应大于22、校正因子测定

内标：正三十二烷，加正己烷溶解稀释成含

1.0mg/lml

进样量：1～3μ13、测定方法取1～3μ1注入气相色谱仪，测定，计算，即得。第132页,共149页，2024年2月25日，星期天(二)HPLC—用外标法可以测定dl–α–生育酚1、色谱条件：★色谱柱：内径4mm,长15～30Cm的不锈钢柱;填充以粒径5～l0μm的十八烷基硅烷键合硅胶固定相★流动相：甲醇-水(49:1)★紫外检测器;波长为292nm★维生素E比醋酸维生素E先出峰，且二峰的分离度应大于2.6。★需做重现性试验，即重复试验3次，峰高的相对标准偏差小于0.8%。第133页,共149页，2024年2月25日，星期天2、测定方法：取供试品液和对照品液各20μl注入高效液相色谱仪中，记录峰高HX和Hr3、计算：供试品中维生素E的量mx(mg)=式中：mr—为生育酚对照品的量，Hx、Hr—为生育酚供试品、对照品中检测得峰高。第134页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）荧光分光光度法1、药物本身具有荧光2、溶剂产生的拉曼光谱影响测定方法的灵敏度和准确度3、采用同步荧光扫描法测定，消除干扰同步荧光扫描法测定血清中VitE的含量第135页,共149页，2024年2月25日，星期天1、仪器：荧光分光光度计2、样品液的制备:样品测定管U、标准管S、空白管B3、测定方法：测定Fu、Fs、Fb4、计算：第136页,共149页，2024年2月25日，星期天Discussion激发波长

295nm发射波长325nm普通荧光同步荧光选择合适的波长差来消除溶剂的干扰第137页,共149页，2024年2月25日，星期天第六节复方制剂中多种维生素的分析离子对HPLC法测