雪莲细胞培养及类黄酮化合物生物合成的调控

雪莲细胞培养及类黄酮化合物生物合成的调控报告提纲一、雪莲花的研究背景二、雪莲植物愈伤组织诱导

三、雪莲高产黄酮细胞系的筛选四、雪莲细胞的固体、悬浮培养（摇床、发酵罐）五、雪莲细胞培养基的选择与优化六、诱导子在雪莲细胞培养中的应用七、毛状根培养技术八、转基因技术在雪莲中的应用九、雪莲细胞大规模培养及其产业化生产有效成分一、雪莲花的研究背景（雪莲的种类及生长环境）雪莲属菊科（Compositae）凤毛菊属（SaussureaDC.）雪兔子属亚属（SubgenEriocoryne(DC.)）和雪莲花亚属（Subgen.AmphilaenaLipsch.）通称为雪莲花。我国雪莲有40多种及3个变种，常被用作生药的雪莲植物有12种和1变种。雪莲花同等入药，但有优劣之分。雪莲产于西藏、新疆、甘肃、青海、四川及云南等地。雪莲通常生长在海拔3500~4500米的高山流石滩上，其生长环境气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温度3-5℃，最低月平均温度零下19—21℃，年降水量800mm，无霜期仅有50天左右。由于环境恶劣，雪莲生长缓慢，4-5年才能开花结实。花期7月，种子8月成熟。续一、雪莲花的主要品种及研究的进展续一、雪莲种类与疗效1.雪莲为菊科风毛菊属多年生草本植物；2.药效显著，为我国传统的珍稀药用植物资源；3.生境恶劣，被列为国家二级珍稀保护植物；4.新疆雪莲(Sausureainvolucrata

)

和水母雪莲(Sausureamedusa)

，用药历史悠久，为雪莲中的上品。功能与主治：民间用于治疗风湿性关节炎、高山不适应和各种妇科疾病等，具有散寒除湿、活血通络的功效。现代药理学研究表明雪莲还具有强心、抗癌、抗氧化、抗疲劳等功能。

续一、雪莲的主要功能和主要成分续一、雪莲的主要药用成份主要药用成份： 黄酮类、木质素类、生物碱类和多糖类物质；雪莲黄酮类物质： 芹菜素、木犀草素、槲皮素、异鼠李素、柯伊立素、高车前素、Jaceosidin、花色素及上述物质的糖甙（例如芦丁）；其他疗效显著的物质：

紫丁香甙、牛蒡子甙、秋水酰碱、雪莲内酯等。续一、雪莲的主要药用成份结构续一、类黄酮化合物合成途径二、雪莲植物愈伤组织诱导（一）、原料植物材料的制备在组织培养中，材料必须完全无菌。有些植物材料的表面有绒毛，消毒剂溶液不容易浸润到表皮，可以在消毒及处理之前先将材料在70%酒精中浸泡数十秒，或者在消毒及溶液中加入几滴表面活性剂T。-80，都会提高杀菌的效果。表面消毒剂对于植物组织也是有毒的。因此要正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以尽量减少组织的死亡。材料在表面消毒处理后，必须在无菌蒸馏水中漂洗3-4次，以除掉所有残留的杀菌剂，否则就会妨碍愈伤组织的发生。续二、雪莲植物愈伤组织诱导以植物的茎、叶、花或茎尖为材料，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。培养基、植物激素、灭菌等基本实验操作技术极为重要！续二、五大类植物激素在组织培养中的作用①生长素；②赤霉素；③细胞分裂素；④乙烯；⑤脱落酸不定根形成的关键是其原基的形成,是一个受激素调控的复杂过程,生长素起关键的调节作用。介绍生长素、乙烯、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和其它植物生长调节物质在不定根形成中的作用,并讨论了它们之间的相互关系。1、生长素：吲哚乙酸促进植物伸长

2、脱落酸：与叶子的衰老、果实的脱落等有关

3、乙烯：促进果实成熟还有生长调节剂

4、细胞分裂素：调节植物细胞生长和发育促进细胞分裂

5、赤霉素（GA）

：是广泛存在的一类植物激素。可刺激叶和芽的生长。

续二、细胞分裂素细胞分裂素（cytokinin;kinetin）从玉米或其他植物中分离到的一种N6-异戊烯腺嘌呤。在植物根部产生的一类促进胞质分裂的物质，促进多种组织的分化和生长。与植物生长素有协同作用。调节植物细胞生长和发育的植物激素。在促进细胞分裂中起活化作用，也包含在细胞生长和分化及其他相关的生理活动过程中，如激动素、玉米素等。细胞分裂素别名：6-BA；6-苄氨基腺嘌呤

三、雪莲高产黄酮细胞系的筛选

植物细胞培养物这些细胞在核型、结构和大小上各不相同，其代谢状态和合成次生代谢物的能力差别也很大。因此，可以利用细胞的异质及变异性筛选出所需要的细胞系。高产细胞系的筛选，通常在愈伤组织团、单细胞克隆或原生质体水平上进行筛选。最简单的方法是当目的产物为色素类化合物，可以用目视来判断和筛选。用目视法从水母雪莲中筛选出比亲本高5-6倍的高产黄酮细胞系。然而并不是所有的细胞和组织都象含色素的细胞那样给人以视觉的直观的标准，因此单干细胞中迹量代谢物测定的技术成为高产细胞系筛选的关键问题，从而出现了放射免疫测定法、酶联免疫测定法、琼脂小块法。续三、雪莲愈伤组织筛选后的红色高产系

四、雪莲细胞的固体、悬浮培养（摇床、发酵罐）

愈伤组织在外植体上形成以后，应及时从外植体上分离下来，转入继代培养基上进行继代培养。一般情况下，从外植体上分离的愈伤组织须经过4～6周的培养才能得到充分的发育。为了增殖发育良好的愈伤组织，继代培养是有效的措施。在良好的培养条件下，愈伤组织可继代一年以上而不丧失分化能力。影响愈伤组织继代培养的主要因素是激素。为协调继代培养中既要维持愈伤组织增殖生长良好、又要保持愈伤组织的分化能力的矛盾，就必须筛选最佳的激素浓度。续四植物细胞系的悬浮培养利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，如植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而利用液体培养基则可以克服这一缺点，我们可以通过震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。

四、雪莲细胞的固体、悬浮培养（摇床、发酵罐）

水母雪莲细胞固体和悬浮培养特点

微生物细胞

植物细胞

大小小

比微生物大10-100倍

细胞壁

无

有

生长形态学

单细胞或菌丝体粘连

细胞通常5-1000个粘连成块，有时更大

接种密度要求大小生长速度

快（以小时计）

慢（以天计）

通气要求

高

低

对剪切力的敏感性

能抗耐

敏感

续四、微生物细胞与植物细胞在细胞培养上的差异

续四、雪莲细胞的发酵培养（2升的生物反应器）

续四、植物细胞悬浮培养溶氧的影响

在植物细胞悬浮培养中，溶氧对细胞的生长和代谢有很大的影响，同时，在培养条件中溶氧也是最复杂的因素之一，溶氧有一定的极限，过高或过低都会影响到细胞生长和产物合成，特别是在高密度培养时，供氧不足往往可能是限制产量的主要因素之一，因此溶氧参数的调控对于植物细胞培养十分关键。如氧分压对三七培养细胞生长以及人参皂苷和多糖合成的影响，发现高的氧分压抑制细胞生长，同时也不利于产物的合成。续四、剪切力对植物细胞悬浮培养的影响植物细胞因其个体大、细胞壁僵脆和具有大的液泡而对剪切敏感，成为植物细胞培养放大的一个主要限制因素.

弄清植物细胞对培养体系流体力学敏感性的调控机理，对植物细胞培养设计合理的反应器和优化操作条件具有重要的作用。植物细胞对流体力学环境的响应依赖于所施加条件的时间和强度以及细胞本身的生理特性。在实际的反应器培养中尚无法定量剪切力与细胞生理响应之间的关系.

.

续四、细胞聚集体对植物细胞悬浮培养的影响

在悬浮培养中,一个成功的细胞悬浮培养体系必须满足悬浮细胞培养物分散性好,细胞团较小,一般由几十个以下的细胞组成，很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系；二是均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同,悬浮系外观为大小均一的小颗粒,在倒置显微镜下观察为体积和形状大致相同的细胞团。聚集体的大小与继代条件、环境条件、反应器构型、培养基组成有关。当然，不同植物种类形成的聚集体大小不同，如水母雪莲（S.medusa）细胞的聚集体为1~5mm，大部分在0.5~3mm。五、雪莲细胞培养基的选择与优化

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。续五培养基的分类（1）为适合多种植物的细胞生长及次生代谢产物含量的提高，许多不同种类的培养基被发展了。按培养基外观的物理状态进行分类:

液体培养基：一类呈液态的培养基。

固体培养基：一类外观呈固态的培养基。根据性质又分为

半固体培养基：指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态的培养基。

脱水培养基：又称预制干燥培养基，指含有除水分外的一切成分的商品培养基。

续五培养基主要成分（2）大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。生长调节包括：(1)植物生长素。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。(2)细胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt）。(3)赤霉素。使用的赤霉素只有一种，赤霉酸（GA3）

续五植物细胞培养常用培养基（3）用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基需要满足各自的特殊要求。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基也就是通常所说的培养基，主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Nitsh、Miller、SH等。完全培养基是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质。如植物生长调节物质和其他复杂有机添加物等。续五培养基制备母液（4）为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。(1)大量元素；(2)微量元素；(3)铁盐；(4)有机物质；(5)植物激素。注意：生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。

续五培养基的保存（5）培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在高压蒸汽灭菌锅120℃条件下，灭菌20分钟。经过灭菌的培养基应置于10℃下保存，特别是含有生长调节物质的培养基，在4～5℃低温下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基最多也不应超过一个月。在多数情况下，应在消毒后两周内用完。(1)防尘；已经灭好菌的培养基要注意防尘；(2)避光：备用培养基应贮于光线较暗处，因为吲哚乙酸等某些物质易见光分解；(3)定期更新。

六、诱导子技术在雪莲细胞培养中的应用诱导子是一类特殊的触发因子，它能够开启代谢过程中酶的活性，因而能够增加次生代谢物的含量，有时甚至可以诱导出新的化合物。诱导子是来自生物的化合物。内生诱导子（endogenouselicitor）：来自植物细胞分子真菌诱导子（fungalelicitor）：来自微生物分子，是一类能引起植物细胞合成积累次生代谢物活性的物质。诱导子对植物具有专一性，在生产次生代谢物时就要选择一种适宜的诱导子。续六、诱导子种类及筛选诱导子:

能够诱导植物细胞产生防御反应的物质。种类：

内源与外源诱导子； 生物与非生物诱导子； 特异与非特异诱导子。 筛选原则： 近缘细胞系；同类代谢物；信号分子。续六、茉莉酸甲酯（MJ）在细胞培养体系中的应用

MJ为内源的非特异性生物诱导子； MJ能够诱导细胞中苯丙氨酸裂解酶(PAL)的重新转录，刺激黄酮类物质的积累。续六、雪莲细胞的生长动态及黄酮产量变化曲线

续六、MJ影响雪莲细胞的生物量MJ对雪莲细胞PAL活性的影响

七、毛状根培养技术在雪莲中的应用

毛状根：又称发状根，发根。整体植株或某一器官、组织（包括愈伤组织）、单个细胞，甚至原生质体受到发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象，是细胞中质粒的T-DNA插入寄主细胞核基因组而得到的表现型，主要是在感染部位上或附近能产生大量的副产物-毛状根。毛状根培养的优点：生物合成能力强、稳定性高、生长快影响毛状根生长及次生代谢物形成的因素：常量元素、微量元素、碳源、pH值、光照、温度、生长调节剂或激素。续七、毛状根培养技术毛状根培养优势：来源于单个细胞、生长迅速（>10倍）、激素自养、再生容易、次生代谢物质合成稳定且含量高；2.本试验所用菌种：A4、R1000、R1601和LBA9402。毛状根筛选路线续七、预培养时间影响R1601侵染频率*基本培养基：N6+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.6-5.8。外植体类型为新疆雪莲叶片。

续七、菌种及外植体类型影响毛状根转化效率续七、新疆雪莲毛状根PCR检测（A）和Southernblot分析（B）

续七、新疆雪莲毛状根中冠瘿碱纸层析分析

续七、野生雪莲和雪莲培养物有效成份含量比较

单位：mg/gdw续七、培养基类型影响新疆雪莲毛状根(HR1601)

生长及紫丁香甙的积累氮源浓度对水母雪莲毛状根生长及黄酮类化合物生物合成的影响氨/硝对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响碳源对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响碳源对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响GA3对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响激素组合对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响Temperature(℃)

温度对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响pH对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响摇床转速对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响光周期对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响接种对照优化MJ(茉莉酸甲酯methyl-jasmonate)添加时间对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响SA(水杨酸salicylicacid）浓度对雪莲毛状根生长及黄酮类化合物生物合成的影响SA添加时间对水母雪莲毛状根生长

及黄酮类化合物生物合成的影响MJ与SA组合对水母雪莲毛状根生长及黄酮类化合物生物合成的影响小结1.R1601，根段(预培养2天)，诱导频率83%；2.Ri质粒的T-DNA已整合到植物基因组并表达；3.HR1601根系生物量（MS，28d），16倍；总黄酮含量为88.6mg/gdw，紫丁香甙含量43.5mg/gdw，分别为野生新疆雪莲的2.5倍和87倍。

八、转基因技术在雪莲中的应用

通过对次生代谢合成关键酶基因的异位表达可以产生不同种类的次生代谢产物或提高含量。研究有效次生代谢产物的生物合成途径，可以人为地对这些化学成分的合成进行生物调控，有利于定向合成所需要的化学成分

。如，日本科学家Hashimoto等将天仙子胺6-β-羟基化酶基因通过Ri质粒导入茛菪毛根中，茛菪胺含量提高了5倍（Hashimotoetal，1993）

续八、查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲

类黄酮生物合成的调控

Smchi基因转化新疆雪莲毛状根提高黄酮类物质生物合成的研究研究内容

①新疆雪莲试管苗生根培养③毛状根培养条件优化④转基因新疆雪莲毛状根的PCR检测⑤转基因新疆雪莲毛状根的PCR-Southern检测⑥转基因新疆雪莲毛状根的生长能力⑦转基因雪莲毛状根根系的总黄酮和芹菜素的生产⑧Smchi基因表达和CHI酶活性分析②发根农杆菌R1601介导新疆雪莲遗传转化体系建立及优化转基因新疆雪莲毛状根的生长能力

(g/L)(g/L)Freshweight(g/L)

Dryweight(g/L)051015C60C57C52C46C41C35C31C29C27C20C18C17C12C7C1Control050100150C60C57C52C46C41C35C31C29C27C20C18C17C12C7C1Control不同新疆雪莲毛状根根系的芹菜素和黄酮含量

(mg/L)(mg/L)

Flavonoids(mg/L)Apigenin(mg/L)0.010.020.030.040.0C60C57C52