全柱成像毛细管等电聚焦电泳应用

成像毛细管等电聚焦技术的应用

翰宇药业研发三部李勇成像毛细管等电聚焦技术的应用

翰宇药业毛细管等电聚焦电泳简介毛细管等电聚焦(capillaryisoelectricfocusing，CIEF)是指在毛细管中进行的等电聚焦。CIEF是根据物质的等电点(pI)不同而进行分离的．采用两性电解质混合物作为载体电解质，当在用溶质和两性电解质混合溶液充满的毛细管两端加电场时，带电的两性离子和蛋白质以不同的速度迁移通过介质，带正电的向负极迁移，带负电的向正极迁移，当它们迁移至pH=pI的区带时，静电荷为零，不再迁移，这个过程称为等电聚焦．CIEF是分析两性生物分子的强有力工具，具有分离时间短、分辨率高、进样量少等优点毛细管等电聚焦电泳简介毛细管等电聚焦(capillary传统CIEF的迁移方式利用电渗流，一般采用采用动态涂敷或化学修饰的毛细管改变阳极或阴极的电解质进行化学迁移，即对蛋白质首先进行聚焦,然后通过阳极加盐或采用碱性电解质(阳极迁移)、阴极加盐或把阴极电解质换为酸来进行(阴极迁移)。流体动力学方法，一般采用重力或者加气压的方式传统CIEF的迁移方式利用电渗流，一般采用采用动态涂敷或化学传统CIEF的问题传统的CIEF使用单点检测器，即使所有样品在到达检测器前已经完成分离，也要等到所有聚焦区带都通过检测器后才能结束分离检测．从形成pH梯度到样品聚焦完成通常只需要5min，而聚焦区带依次通过检测器却需要10～40min，不仅增加了额外的分析时间，并且移动过程会导致分离谱带展宽而影响分离度和分辨率，还可能导致蛋白质沉淀。传统CIEF的问题传统的CIEF使用单点检测器，即使所有样成像毛细管等电聚焦优势全柱成像检测(wholecolumnimagingdetection，WCID)克服了传统CIEF的不足，采用一个动态检测器如电荷耦合装置(CCD)照相机或光二极管阵列(PDA)对整个分离毛细管柱(5cm或更短)进行实时检测．整个毛细管内不同时间与不同位置上发生的任何事件均能得到检测．WCID不仅能对样品进行常规的分离分析，还能在分离的同时提取出有关动态过程的动力学参数，从而获取多重信息．因此，CIEF－WCID技术在生物样品的分离分析、蛋白质组学的研究中有着广泛的应用前景．因此CIEF－WCID对比传统的CIEF优势在：不需要迁移分析时间快重复性好能够实时监控成像毛细管等电聚焦优势全柱成像检测(wholecolumiCE-280的结构图280nmUViCE-280的结构图280nmUVcIEFwithoutMobilization

TheiCE280iCE-280的结构图cIEFwithoutMobilization

TheCIEF-WCID在抗体方面的应用羧肽酶去除C末端赖氨酸后，继续分析其电荷异质性，结果如图B所示。抗体1主峰后的2个碱性峰均消失，证明这2个碱性峰为C末端赖氨酸不均一性所引起CIEF-WCID在抗体方面的应用羧肽酶去除C末端赖氨酸后CIEF-WCID在抗体方面的应用为判断末端赖氨酸不均一性对其电荷异质性的贡献，将抗体2用羧肽酶

去除C末端赖氨酸后，分析其电荷异质性，结果如图B所示。抗体2主峰后的2个碱性峰均消失，证明这2个碱性峰为C末端赖氨酸不均一性所引起。但是经羧肽酶B酶切后，其主峰前仍有2个比例较高的酸性峰，为判断唾液酸修饰对其电荷异质性的贡献，将羧肽酶酶切后的抗体2继续用N－糖苷酶酶切，分析其电荷异质性，结果图C所示，经过2个酶切处理后，抗体2的图谱基本上只剩1个主峰，证明抗体2的电荷异质性主要是有C末端赖氨酸的不均一性和唾液酸修饰所引起。CIEF-WCID在抗体方面的应用为判断末端赖氨酸不均一性对CIEF-WCID在抗体方面的应用由于单抗的分子量巨大，在生产及储存过程中可产生大量的修饰，如糖基化、N末端的焦谷氨酸化、C末端的赖氨酸截除、氧化、脱酰胺等等，理论上这些异质性的组合可使单抗分子产生约10*8种异构体。这些异构体的组合形成了单抗的大小异质性、电荷异质性和糖基化修饰的异质性等。电荷异质性其碱性峰来源于C末端赖氨酸的不均一性、甲硫氨酸氧化、天冬氨酸转变为丁二酰亚胺等，其中主要为C末端赖氨酸的不均一性;酸性峰则来源于N－糖末端的唾液酸化修饰、氨基酸残基的脱酰胺等。由于单抗制品高度复杂的异质性，其质控需要组合多种理化分析技术对其进行检测。对于电荷异质性分析，成像毛细管等电聚焦电泳为对其进行分析提供了一个快速、灵敏、高分离度的选择，对保证单抗类生物技术药物生产工艺的稳定性及控制其质量和提高质量标准均具有重要意义。CIEF-WCID在抗体方面的应用由于单抗的分子量巨大，在生CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID分析重组人促红素(rhEPO)尿素摩尔浓度的选择CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID分CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID分析重组人促红素(rhEPO)两性电解质的选择CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID分CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID对重组人促红素(rhEPO)的异构体和等电点进行了分析对聚焦时间的考察，能够实时监控CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID对CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID分析重组人促红素(rhEPO)很多含唾液酸残基的糖蛋白类生物制品一样，rhEPO样品是由不同的异构体组成的。由于糖链分支顶端的唾液酸残基的差异，使得rhEPO的带电性发生改变。重组人促红素因糖基化的差异产生多种异构体，每种异构体对生物学活性贡献不同，如何有效控制各种异构体的含量成为重组人促红素生产的关键，而rhEPO质量控制是确保各种异构体的含量达到一定的比例。由于没有一种稳定、重复性好的分析技术和仪器，异构体差异无法准确定量，rhEPO质量控制标准不完善，无法完全保证药品的质量和产品的均一性。而成像毛细管等电聚焦技术为分析糖基化的差异产生的多种异构体提供了可能，为重组人促红素质量控制提供了有效手段。CIEF-WCID分析糖蛋白的电荷异质性CIEF-WCID分CIEF-WCID在PEG修饰蛋白药物中的应用PEG化药物关键质量控制难点聚乙二醇的平均修饰率（一个蛋白分子上平均修饰几个PEG分子）修饰均一度：单修饰物位置异构体含量百分比（对单一修饰而言），不同修饰个数PEG修饰成份的含量百分比（对随机多位点修饰而言）PEG修饰位点确认CIEF-WCID在PEG修饰蛋白药物中的应用PEG化药物关板状电泳分析PEG蛋白SDS-PEG分子量偏离迁移速度变慢模糊连片的条带甚至找不到条带IEF分离pI值偏离迁移速度变慢模糊连片的条带甚至找不到条带PEG长链与电泳凝胶的相互作用；PEG本身对电荷的屏蔽PEG蛋白的泳动会比蛋白慢很多，电泳完成时间难以确定板状电泳分析PEG蛋白SDS-PEGIEF分离PEG平板IEF分析PEG修饰蛋白PEG修饰的尿酸氧化酶平板IEF分析PEG修饰蛋白PEG修饰的尿酸氧化酶HPLC方法困难：因为PEG化，样品在色谱柱上保留和洗脱行为发生偏离：现象：1，矮胖峰

2，不出峰

3，出峰行为反常PEG支链影响样品分子难以进入填料小孔PEG改变了分子的疏水性，PEG链与色谱介质的相互作用，相同分子量下前者比后者的水化体积高两倍，GPC的保留时间并不直接与PEG修饰后引起的分子量增加相关PEG对蛋白的包裹作用，干扰蛋白电荷和离子交互介质带电基团的作用HPLC方法困难：因为PEG化，样品在色谱柱上保留和洗脱行为HPLC方法HPLC方法蛋白PEG往往导致电荷的变化PEG蛋白或多肽在PEG化工程中，很多的连接方法是peg连接在带电荷的侧链基团或末端基团上（比如氨基）上，因为PEG常常原本带正电荷的氨基连接，所以每个带正电荷的氨基连接了PEG，那么就被屏蔽一个正电荷。蛋白PEG往往导致电荷的变化PEG蛋白或多肽在PEG化工程中PEG修饰位点解析在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的E氨基。PEG修饰位点解析在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有屏蔽一个带电基团(比如氨基），电荷差异反映在pI值上约有0.1-0.3的差异屏蔽一个带电基团(比如氨基），电荷差异反映在pI值上约有0.pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.01个氨基结合PEGpI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.01pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.02个氨基结合PEGpI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.02pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.03个氨基结合PEGpI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.03pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.04个氨基结合PEGpI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.04pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.05个氨基结合PEGpI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.05其他形式的PEG结合方式，导致的电荷变化很小（0.01-0.05左右）比如结合在同一个氨基上的不同长度不同方式的PEG结合（屏蔽）同一数量的氨基，但结合位置不同上述两种方式的组合PEG结合在蛋白的其他非带电基团上（比如半胱氨酸的巯基）其他形式的PEG结合方式，导致的电荷变化很小（0.01-0.pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.0电荷变化很小（0.01-0.05左右），难以分成独立的峰，使原有的峰变宽pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.0电pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.0PEG蛋白使得原来的蛋白峰更宽pI值光吸收值6.06.57.07.58.08.59.0P

CIEF-WCID分析PEG修饰的尿酸氧化酶PEG大多修饰在蛋白表面的赖氨酸上，减少了蛋白表面的正电荷；往往蛋白结合的PEG数量越多，带正电荷就越少，蛋白的等电点降低得越多CIEF分析结果‘ExPASy’等蛋白分析软件分析原型蛋白在去除不同修饰位置处的赖氨酸后得到的等电点，将两者进行等电点结果比对后，可对其不同修饰个数的PEG-UOX峰进行归属CIEF-WCID分析某细胞因子及其PEG化的iCE-280结果Non-PEGylatedPEGylatedNon-PEGylatedDeamidation某细胞因子及其PEG化的iCE-280结果Non-PEGylPEG化工艺（专一性）的不同PEG化工艺（专一性）的不同