下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)

前言口咽部正常菌群常见的肺部感染机制：吸入性：定植菌吸入肺部呼入性：呼吸机、气溶胶等血播性：见于静脉吸毒或血透患者前言口咽部正常菌群1下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)2分析前下呼吸道标本检验标本采集咳痰诱导痰（高渗盐水诱导3%NaCl20-30ml）分析前下呼吸道标本检验标本采集3气管和内镜吸出物（气管插管24h，就有定植菌，仅有临床症状时，否则切勿培养气管吸出物）气管镜标本（由肺科医生或受训后医生采集）支气管肺泡灌洗液（BAL）支气管灌洗液，保护性毛刷标本（PSB），支气管穿刺活检标本支气管灌洗液-BAL-PSB-穿刺活检标本气管和内镜吸出物4标本运送无菌杯条码1－2h内送检

超时，苛养菌如肺炎链球菌减少，口咽部正常菌群将过度生长标本运送无菌杯5标本拒收规则不接受48h内重复送检培养的标本拒收以下标本申请做下呼吸道感染诊断：24h内采集的痰标本口水诱导痰鼻冲洗液和分泌物或鼻孔拭子标本延迟>2h且未冷藏，应报告中注明标本延误送检，可能对培养结果造成影响咽部标本厌氧培养标本支气管刷培养，只能用保护性毛刷支气管灌洗液，气道分泌物。标本拒收规则不接受48h内重复送检培养的标本24h内采集的痰6污染痰标本和气管内标本革兰染色拒收条件的评价

（痰涂片20－40/LP；气管吸出物低倍镜和油镜下都要检测）不合格标本有：痰标本=

10个上皮细胞/低倍视野但如果WBC数是上皮细胞数的10倍，单一形态的细菌量达到3+至4+，可接受标本进行培养成年人支气管吸出物：10SECs/LPF或未见细菌患儿支气管吸出物：未见细菌

如WBC4+，并可见纤维细胞，但未见细菌，最好重新涂片做吖啶橙染色，用荧光显微镜观察弹性纤维上是否有细菌，假单胞菌和嗜血杆菌可能会在这类涂片中漏检；

还可以见军团菌，此类感染中常缺少白细胞。污染痰标本和气管内标本革兰染色拒收条件的评价

（痰涂片207门诊接受到大量脓性标本，应立即接种，不必等待涂片结果。拒收培养标本报告方式：“涂片所见：每低倍镜视野含＝10个扁平上皮细胞，提示标本质量差，不做培养；如果有临床指征请重新采集标本”“涂片检查40个视野，未见细菌，不做培养；如果临床指征请与实验室联系”不能拒收标本送检军团菌培养、抗酸染色痰标本、气管吸出物和来自囊性纤维化患者的痰标本门诊接受到大量脓性标本，应立即接种，不必等待涂片结果。8分析中下呼吸道标本检验接种II级生物安全柜内进行尽快处理挑取最脓或血色最浅标本支气管镜标本，做细菌定量培养的BAL和或PSB标本切勿离心。涂片，革兰染色分析中下呼吸道标本检验接种9标本接种血平板、巧克力平板和麦康凯（或中国蓝/伊红美兰）以下步骤可选择一项或多项：在接种后的巧克力平板上贴杆菌肽纸片（10IU），用于抑制上呼吸道微生物菌群，提高流血嗜血杆菌检出率用金葡ATCC25923点种接种后的血平板，便于直接观察嗜血杆菌的卫星现象血平板的第二个1/4区贴奥普托辛(OP)纸片，可在原始平板上直接检测抑制肺炎链球菌的生长。不推荐常规使用，如有大量社区感染肺炎患者标本时可考虑使用标本接种10培养35－37℃、5%CO2条件培养48h，最好至72h；侵入性方法采集的肺标本，培养延长至4天培养11直接试验革兰染色

注明细胞、细菌量以及评价结果见表3胆汁溶菌试验革兰阳性双球菌直接试验12表3痰涂片革兰染色结果解释指征解释每个低倍镜视野发现>10个鳞状上皮细胞标本含有唾液和上呼吸道分泌物，报告“>10个扁平上皮细胞/低倍视野，提示标本被唾液污染，将不再进行培养”每低倍镜视野发现<10个扁平上皮细胞，大量多形核白细胞，存在肺泡巨噬细胞和柱状上皮细胞提示是一个良好的深部痰标本大量多形核白细胞胞内细菌弹性蛋白或胶原纤维提示感染Curschmann’s螺旋纤维提示感染淀粉样小体坏死白细胞提示感染粉色絮状物提示呼吸道疾病治疗产生的雾状高渗水Charcot-Leyden结晶提示过敏性肺曲霉病大量多形核白细胞，主要见革兰阳性球菌成对或成短链排列可疑肺炎链球菌。电话通知临床医生表3痰涂片革兰染色结果解释指征解释每个低倍镜视野发现>113指征解释大量多形核白细胞，主要见革兰阳性球菌成堆排列可疑金黄色葡萄球菌。电话通知临床医生大量多形核白细胞，主要见革兰阴性双球菌可疑卡他莫拉局限性肺炎菌。电话通知临床医生大量多形核白细胞，主要见小的革兰阴性球杆菌可疑流感嗜血杆菌。电话通知临床医生大量多形核白细胞，主要见大而胖的革兰阴性杆菌可疑克雷伯菌或其他肠杆菌科菌引起的肺炎大量多形核白细胞，大量小的革兰阴性杆菌，球杆菌，革兰阳性球菌成链排列以及其他不同形态的细菌提示吸入性肺炎。这需要在报告中特别提示，因为培养结果会显示正常菌丛生长。电话通知临床医生出芽酵母样孢子和假菌丝通常提示鹅口疮或上呼吸道酵母菌感染，不是肺炎，仅当其为主要所见菌时报告其他异常结构，如真菌，分枝的革兰阳性丝状杆菌或奇特形状的细菌（可能抗生素治疗的结果）请高级医师进行确认，可能需要补充实验如改良的抗酸染色指征解释大量多形核白细胞，主要见革兰阳性球菌成堆排列可疑金黄14培养结果检查观察24h后平板继续培养平板24－48h，为检出霉菌、慢生长菌、苛养的革兰阴性杆菌如博德特菌属革兰染色结果解释培养结果炎性细胞和细菌来决定对培养物下一步处理如培养与涂片不符，重新读片按照表4报告鉴定以下有临床意义的可疑致病菌，排除正常菌群培养结果检查15常见呼吸道重要致病菌链球菌苛养革兰阴性菌革兰阴性双球菌革兰阴性杆菌葡萄球菌革兰阳性杆菌常见呼吸道重要致病菌16链球菌Beta-溶血、触酶阴性呈链状或成对排列的球菌化脓链球菌（PYR+）任何数量都要报告患儿标本检查有小溶血环并鉴定B群-溶血链球菌，任何数量都要报告优势菌时，有意义数量的Beta-溶血链球菌不要报告小菌落的beta-溶血链球菌或F群链球菌，因为这些菌是上呼吸道正常菌群链球菌17下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)18下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)19链球菌Alpha-溶血链球菌Optochin敏感实验胆汁溶菌实验（联合上述两个实验进行鉴定）药敏实验，贴OP纸片确认纯度以检查药敏结果是否有污染链球菌20下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)21苛养革兰阴性杆菌流感嗜血杆菌，卫星现象，ALA实验确认鉴定并作beta-内酰胺酶试验。百日咳博德特菌触酶和尿素酶阳性，培养48h出现肉眼可见菌落巴斯德菌吲哚和氧化酶阳性，动物口腔正常菌群侵蚀艾肯菌上呼吸道正常菌群，无需鉴定苛养革兰阴性杆菌22下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)23革兰阴性双球菌卡他莫拉菌G-双球菌，氧化酶阳性，血平板上可推动，丁酸盐试验阳性淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌？

需检验并报告，不需做药敏试验当培养达到有意义数量时，即使不是优势菌，也报告（表4）革兰阴性双球菌24下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)25在麦康凯或伊红美兰平板生长良好的革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌鉴定和药敏试验对于住院患者，不管是否有其他病原菌，检查有意义数量的铜绿假单胞菌、不动杆菌、博克霍尔德菌和嗜麦芽菌囊性纤维化患者标本有特殊要求在麦康凯或伊红美兰平板生长良好的革兰阴性杆菌26下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)27囊性纤维化患者标本操作规范菌名鉴定特殊处理丝状真菌任何数量鉴定到种水平肠杆菌科优势菌做药敏实验金黄色葡萄球菌任何数量做药敏实验，做苯唑西林筛选流感嗜血杆菌优势菌做beta-内酰胺实验肺炎链球菌优势菌用苯唑西林纸片做青霉素耐药筛选。若需要做青霉素E-test铜绿假单胞菌，洋葱克雷伯，其他非发酵菌任何数量做药敏实验快速生长分枝杆菌任何数量鉴定到种水平囊性纤维化患者标本操作规范菌名鉴定特殊处理丝状真菌任何数量鉴28葡萄球菌痰涂片显示有优势的呈堆球菌并与白细胞相关，没有其他致病菌时，鉴定有意义菌量的金黄色葡萄球菌住院患者，鉴定并作苯唑西林耐药仅当菌量达到90%纯培养时，鉴定凝固酶阴性葡萄球菌，无需鉴定到种水平，无需做药敏葡萄球菌29下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)30肠球菌不要报告肠球菌，除非达到90%纯培养很多革兰阳性球菌都是呼吸道正常菌群肠球菌31革兰阳性杆菌排除任何数量来自免疫抑制患者的奴卡菌和马红球菌（粘液样并尿素酶阳性）

马、猪等动物致病菌，可条件致病，可以导致免疫抑制患者的肺炎大芽孢革兰阳性菌，则需排除炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌快速尿素酶阳性（假白喉棒状杆菌），或标本来自ICU插管患者时，鉴定大量优势的棒状杆菌其他革兰阳性杆菌不会引起肺炎，无需鉴定革兰阳性杆菌32下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)33下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)34霉菌念珠菌不能引起肺炎，除非肿瘤患者、肺移植患者或新生儿。酵母菌是口腔正常菌群。霉菌35下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)36如果涂片时见到细菌但培养不生长，扩大培养，可能存在军团菌、百日咳博德特菌和分枝杆菌。如果涂片时见到细菌但培养不生长，扩大培养，可能存在军团菌、百37表4下呼吸道培养致病菌报告指南表6常见可疑菌落形态及快速经典方法初步鉴定表4下呼吸道培养致病菌报告指南38检测病原菌检验并报告化脓链球菌B群beta-溶血链球菌（儿童）博德特菌属，特别是支气管博德特菌奴卡菌新型隐球菌淋病奈瑟菌弗朗西斯吐拉菌（高致病菌）鼠疫耶尔森菌（高致病菌）炭疽芽孢杆菌（高致病菌）霉菌，排除腐生菌污染当培养少量，涂片也见到时报告肺炎链球菌，报告药敏流感嗜血杆菌，报告beta-内酰胺酶当培养达到有意义数量时，即使不是优势菌，也报告卡他莫拉菌脑膜炎奈瑟菌只对住院患者报告：铜绿假单胞菌，报告药敏嗜麦芽窄食单胞菌不动杆菌，报告药敏伯克霍德菌，报告药敏检测病原菌检验并报告化脓链球菌当培养少量，涂片也见到时报告肺39检测病原菌当培养达到有意义数量，并且是优势菌，特别是涂片提示多形核白细胞与培养一致，报告金黄色葡萄球菌，报告药敏B群beta-溶血链球菌（成人），C、G群单一形态革兰阴性杆菌（肺克）报告药敏苛养革兰阴性杆菌，报告beta-内酰胺酶尿素阳性棒状杆菌或来自ICU来自免疫抑制患者，马红球菌报告“肠道革兰阴性杆菌”在麦康凯平板上生长1种以上革兰阴性杆菌，氧化酶阴性，吲哚阳性，乳糖阳性或蔓延生长报告“非发酵革兰阴性杆菌”在麦康凯平板上生长1种以上革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，三糖铁上不发酵葡萄糖报告“分离到上呼吸道细菌”，注如果只存在肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌（有或没有酵母菌），报告“混合有革兰阳性微生物细菌，或如果90%是培养物，则做少量鉴定列出”草链和或非致病的奈瑟菌，类白喉菌、凝固酶阴性葡萄球菌、Rothia罗思氏菌、F群链球菌，厌氧菌，嗜血杆菌属（非流感），艾肯菌，放线杆菌嗜二氧化碳菌，莫拉菌，肠球菌，酵母菌和有意义数量的金黄色葡萄球菌，革兰阴性杆菌和脑膜炎奈瑟菌检测病原菌当培养达到有意义数量，并且是优势菌，特别是涂片提示40分析后下呼吸道标本报告分析后报告结果革兰染色不要报告涂片中所见的少量菌（<1/20视野）；如果未分离到涂片中所见细菌，在报告中注明。如果任何平板上都没有细菌生长，报告“无致病菌生长或正常上呼吸道微生物”，注意抗生素抑制生长阳性报告参照表4指南报告结果和药敏；药敏结果依据CLSI结果解释阳性注意假阳性（携带菌）；阴性不能排除感染分析后下呼吸道标本报告41局限性常规培养方法不生长假阴性培养可能由正常菌群污染或事先使用了抗生素假阳性结果可能会对培养结果过度解释局限性42参考文献SusanE.Sharp,AnnRobinsonandMichaelSaubolle,etc.2004.CumulativeTechniquesandProceduresinClinicalMicrobiology7B,LowerRespiratoryTractInfections.

ASMPressWashington,D.C.Murray,.R.,Baron,E.J.,Pfaller,M.,Tenover,F.,andYoken,R.2006.ManualofClinicalMicrobiology,9thed.ASMPress,Washinton,D.C.参考文献43THANKYOUTel:62362312E-mail:zhongqiao83yahooTHANKYOUTel:62362312449、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。2024/4/