细菌耐药性监测与临床

关于细菌耐药性监测与临床

为什么要检测耐药菌

感染病原的变迁造成现代感染模式耐药菌株的流行临床的需要(指导感染性疾病的个体化治疗，细菌的耐药性监测指导经验治疗)第2页,共71页，2024年2月25日，星期天2007年肠杆菌属细菌耐药率（%）抗菌药物耐药敏感阿米卡星13.779.6庆大霉素2868.9哌拉西林48.644.8哌拉西林/他唑巴坦22.465.2头孢呋辛54.539.3头孢噻肟37.746.8头孢他啶36.959头孢吡肟14.379.7头孢哌酮/舒巴坦976.4头孢西丁98.71.3亚胺培南0.998.9美罗培南0.998.9环丙沙星2370.3复方磺胺甲噁唑34.763.9对头孢哌酮/舒巴坦、碳青霉烯类、头孢吡肟和阿米卡星的耐药率较低（＜15%）第3页,共71页，2024年2月25日，星期天2007年12家医院3988株铜绿假单胞菌耐药率（%）抗菌药物耐药敏感阿米卡星18.773.9庆大霉素39.256.2哌拉西林40.159.9哌拉西林/他唑巴坦32.867.2替卡西林/克拉维酸5050头孢哌酮40.345.4头孢他啶29.365.2头孢吡肟2663.2头孢哌酮/舒巴坦22.854.8氨曲南31.248.4亚胺培南35.861.4美罗培南28.566.6环丙沙星29.861.2碳青霉烯类的耐药率为28~36%，亚胺培南比美罗培南略高对所测试抗菌药的耐药率均接近20%或以上第4页,共71页，2024年2月25日，星期天2007年12家医院3157株不动杆菌属细菌的耐药率（%）抗菌药物耐药敏感阿米卡星51.846.4庆大霉素62.536.4氨苄西林/舒巴坦43.343.5哌拉西林/他唑巴坦54.437.8头孢噻肟62.56.7头孢他啶52.439.7头孢吡肟5539.3头孢哌酮/舒巴坦5.373.9头孢西丁97.42.6亚胺培南35.363.1美罗培南39.958.6环丙沙星6037.3米诺环素32.954.2头孢哌酮/舒巴坦耐药率低，对所测试抗菌药耐药率均较高两种碳青霉烯类耐药率均＞35%第5页,共71页，2024年2月25日，星期天细菌产生耐药性的原因分裂繁殖方式：以其二分裂繁殖方式使自身可在很短的时间里分裂繁殖，使自身增加数百亿万倍，有利于耐药性的播散。耐药机制的产生：细菌可以通过多种耐药机制对抗生素产生耐药性，产生各种灭活酶、抗生素膜渗透障碍、靶位的改变等.第6页,共71页，2024年2月25日，星期天细菌产生耐药性的原因抗菌药物的发现和广泛应用环境的原因早在抗生素应用以前有些细菌就具有备抗药基因。细菌存在于地球上已有3乙多万年了，早在人工合成的抗生素使用之前，细菌就与自然界中的一些天然的抗菌成分以及其他微生物产生的抗菌物质广泛接触而获得了耐药基因。（放线菌的代谢产物、天然的植物、中草药等）。第7页,共71页，2024年2月25日，星期天菌产生耐药性的原因自从青霉素（1942年在美国首次）应用于临床后2-3年内，75%的葡萄球菌对其产生了抗药性，目前葡萄球菌产酶株在95%-100%，对青霉素均耐药。1959年耐酶青霉素的合成并投入使用，仅2年时间1961年英国就报道分离出MRSA并且耐药菌迅速在世界扩散。目前我国临床实验室分离的金葡菌有近50%的为MRSA。第8页,共71页，2024年2月25日，星期天

耐药菌产生的原因

耐药菌株被迅速选择和扩散：1940-1960：青霉素时代1960-1973:广谱青霉素、二代头孢时代1978-1995：广谱内酰胺类、氟喹诺酮类其结果：耐药菌株被迅速选择和扩散第9页,共71页，2024年2月25日，星期天菌产生耐药性的原因在世界许多地方，抗生素使用于农业、渔业、林业水产及家禽养殖业中，在施肥与饲料中被常加入抗生素，这样做结果是大量杀灭了自然界中的敏感菌株而选择出了耐药菌株，这些耐药菌株最终可以通过食物链或直接接触传递给人。第10页,共71页，2024年2月25日，星期天细菌产生耐药性的原因世界范围内迅速扩散

人口密度过大1万年前地球人口只有100～200万，而现在已有60亿，人群之间有了更多接触机会；高度繁荣的旅游业、大量的旅游流动人口，使在某一处发生的耐药菌可以没有国界地迅速地扩散到世界各地。

第11页,共71页，2024年2月25日，星期天细菌产生耐药性的原因正常情况下，每一类细菌产生的耐药性只发生于少数细菌中，难以与压倒多数的优势敏感菌竞争，故危害性较小，只有当敏感菌因抗生素的选择压力作用下而被大量杀灭后。耐药菌才大量繁殖而成为优势菌，并导致耐药菌的产生。因此，细菌耐药性的发生和发展是抗菌药物广泛应用尤其特别是无指征滥用的结果。第12页,共71页，2024年2月25日，星期天细菌产生耐药性的原因现代医学的发展促进了耐药菌的产生

新的技术如静脉导管、人工瓣膜、介入治疗、切开引流、人工呼吸等，为一些机会致病菌提供了进入人体的通道，而这些机会致病菌比有毒力的致病菌更易产生耐药性。

第13页,共71页，2024年2月25日，星期天细菌产生耐药性的原因此外，大量抗生素的发现使临床医生有过多的选择余地，所以在感染性疾病的治疗上很少强调改善宿主的功能，也不采用针对不同病原菌敏感的抗生素治疗，而一开始就选择使用广谱抗生素其，结果必然是导致了大量耐药菌株的产生。抗菌药物的使用不当同时也促进了耐药菌在机体内和医院环境中的定植繁衍，进而导致交叉感染和内源性感染日益增多。第14页,共71页，2024年2月25日，星期天

细菌的耐药机制

遗传学机制：染色体介导的耐药/突变耐药质粒介导的耐药性/获得性耐药生物化学机制——表达：产生灭活酶/钝化酶抗生素渗透障碍靶位的改变其他机制产生拮抗物改变代谢状态、如呈休眠状态、营养缺陷等第15页,共71页，2024年2月25日，星期天

细菌的耐药机制

第16页,共71页，2024年2月25日，星期天临床病原菌产生的重要的水解酶

窄谱β-内酰胺酶β-内酰胺酶

超广谱酶AMpC酶KPC酶其他酶第17页,共71页，2024年2月25日，星期天临床上最重要的革兰阴性菌β内酰胺酶超广谱β内酰胺酶（ESBLs）头孢菌素酶（AmpC酶）碳青霉烯酶（KPC酶）第18页,共71页，2024年2月25日，星期天

革兰阴性菌对β内酰胺类药物的

耐药性及检测方法

β内酰胺酶的分类1耐药机制分类质粒介导TEM、SHV、OXA等染色体介导TYPEＩ(AmpC酶)2分子生物学分类（Ambler)

A、B、C、D四类功能分类—Bush分类1、2、3、4个组第19页,共71页，2024年2月25日，星期天第20页,共71页，2024年2月25日，星期天超广谱β内酰胺酶

ExtendedSpectrhmβ-lactamases

基本概念（1）主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆科细菌产生.（2）在体外试验中可使三代头孢和氨曲南的抑菌圈缩小，但并不一定在耐药范围。（3）加入克拉维酸可使抑菌圈扩大（对酶抑制剂敏感）。（4）临床对β内酰胺类药物（包括青霉素类和头孢类）耐药，但对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感。（5）由质粒介导，往往由普通的β内酰胺酶基因突变（TEM-1，TEM-2和SHV-1）而来。第21页,共71页，2024年2月25日，星期天

ESBLs的发现和流行情况

产生基础最常见的由质粒介导的β内酰胺酶是TEM-1，TEM-2和SHV-1酶，这些酶仅对第一代头孢菌素有弱水解活性（广谱酶）。80年代中期，由于临床上广泛使用头孢类抗生素尤其是头孢他啶和头孢曲松，导致TEM-1和SHV-1β内酰胺酶突变酶的出现。首次发现1982年，英国1983年，德国目前状况肺炎克雷伯菌是产生ESBL的最常见菌，产酶可高达40%以上，我院2007年肺炎克雷伯菌产ESBL达37%—38%，大肠产酶达40%，肠杆科其他菌如产酸克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌中也可分离到ESBL。第22页,共71页，2024年2月25日，星期天

肠杆科细菌产ESBLs概况TEM-1最普遍,典型的情况是TEM-型和SHV-型的ESBLs由大的多重耐药质粒编码ESBLs类型多且都有自己特异的底物和酶活性，是针对不同类型的广谱β内酰胺类抗生素或β内酰胺酶抑制剂产生的耐药,迄今已发现有上百种类型的ESBLs肠杆科细菌大多都具产酶能力.第23页,共71页，2024年2月25日，星期天ESBLs流行特点

1、世界范围流行，但有区域性2、确切的流行情况不清楚（耐药表型不明确，有不均一表现）3、主要见于医院感染4、ESBLs的编码基因在质粒上，易造成在不同菌株中的播散，5、对酶抑制剂敏感；对EDTA不敏感；第24页,共71页，2024年2月25日，星期天

ESBLs的耐药机制基因突变耐药基因由质粒携带ESBLs多由普通的β内酰胺酶基因发生突变而来。Gly→Ser-238突变引起酶的活性区扩大，导致对氧化亚氨基头孢菌素的亲和力和水解活性升高，体外诱变也证实第168和238位的置换可增强对氧化亚氨基β内酰胺类抗生素的水解活性。第25页,共71页，2024年2月25日，星期天★ESBLs耐药特点1、青霉素类、一、二、三代头孢菌素、（部分可水解四代）和单环酰类抗生素均耐药2、对碳青霉烯类和头霉素类敏感3、对酶抑制剂敏感4、产生ESBLs的细菌往往多重耐药。其质粒上常有氨基糖苷类、氯霉素或TMP-SMZ等的耐药基因。（例有统计产酶株AMK70.37%耐药、CIP75.30%耐药；不产酶株分别为13.20%、35.81%）第26页,共71页，2024年2月25日，星期天

产ESBLs细菌感染的临床表现1、临床表现难以治愈的感染或反复复发的感染。2、三代头孢菌素治疗临床无效。第27页,共71页，2024年2月25日，星期天ESBLs表型的检测筛选试验

标准纸片琼脂扩散法MIC肉汤稀释法检测双纸片协同试验确认试验

纸片确认试验MIC肉汤稀释法仪器E-testPCR检测第28页,共71页，2024年2月25日，星期天第29页,共71页，2024年2月25日，星期天第30页,共71页，2024年2月25日，星期天标准纸片琼脂扩散法

培养基：

Muller-Hinton琼脂药敏纸片头孢泊肟(10ug/片)、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南（均为30ug/片）中至少二种：接种方法标准纸片扩散法孵育条件、时间：35℃、空气、16—18小时第31页,共71页，2024年2月25日，星期天标准纸片琼脂扩散法

判断标准：头孢泊肟的抑菌环直径≤17mm头孢他啶的抑菌环直径≤22mm头孢曲松抑菌环直径≤25mm孢噻肟和氨曲南抑菌环直径≤27mm有一种药敏纸片结果在此范围均应高度怀疑为产ESBLs株应进一步做确认试验，报告方式：疑似产ESBLs株，所有的青霉素类、头孢菌素类（包括三、四代头孢）单环酰胺类均视为耐药；方法的局限性易漏检

第32页,共71页，2024年2月25日，星期天常规药敏试验：细菌对药物MIC/直径往往可能落在敏感范围，所以尽可能检测其耐药机制第33页,共71页，2024年2月25日，星期天检测ESBLS的意义一旦诊断为产ESBLs所有的青霉素类、头孢菌素类（包括三、四代头孢）单环酰胺类均视为耐药，无论体外试验是否敏感。第34页,共71页，2024年2月25日，星期天案例患者，女，48岁，因尿频、尿急、肉眼血尿收住本院干部病房，临床诊断：尿路感染，给予三代头孢，静脉滴注一周，症状好转出院。一周后复发，再次入院，治疗同前，好转出院，再次复发。细菌培养：大肠埃希菌，产ESBL敏感的抗生素：亚胺培南、头孢西丁、呋喃妥因。自购呋喃妥因治疗后没有复发。第35页,共71页，2024年2月25日，星期天头孢菌素酶(AmpC酶)BushＩ酶基本概念:1、AmpC酶又称BushＩ酶，它的产生是由染色体上的AmpC基因所编码产生;2、分类属Bush

Ｉ型。3、几乎所有的革兰阴性杆菌均可产生此酶，通常这种酶的表达水平很低，但在有诱导剂存在时，酶的产生会大大增加（表达水平增加到10～100倍），因此这类酶又叫诱导酶。

第36页,共71页，2024年2月25日，星期天主要产酶菌株

绿脓杆菌

100%吲哚阳性的变形杆菌100%；肠杆菌属：80%；枸橼酸杆菌属：80%；沙雷菌属：80%；沙门菌属：80%第37页,共71页，2024年2月25日，星期天产生机制：诱导：染色体AmpC基因通常处于关闭/抑制状态,AmpC基因的编码作用被AmpD基因所抑制，当AmpD基因发生去抑制突变时（去阻遏）抑制作用被解除，AmpC基因编码产生高产AmpC酶。这个酶可以水解所有三代头孢菌素，并且不被酶抑制剂所抑制。

β内酰胺类抗生素存在与环境中，与细菌细胞壁上的青霉素结合蛋白结合，PBPS4、7a、7b被激活,三个PBPS被激活就可启动AmpC基因，诱导AmpC酶表达。活化因素就是抗生素。第38页,共71页，2024年2月25日，星期天头孢菌素酶(AmpC酶)BushＩ酶诱导剂：β内酰胺类抗生素亚氨培南是潜在的酶诱导剂，但没有去阻遏用；许多三代头孢菌素是弱诱导剂，但有选择去阻遏作用；第39页,共71页，2024年2月25日，星期天AmpC酶分类1、染色体AmpC酶：（Bush

Ｉβ内酰胺酶）

2、质粒型AmpC酶：

近年来还发现了质粒介导的AmpC酶。上述的AmpC基因活化结果有两种表达：（1）可逆性当去除诱导剂后，酶的表达水平将恢复到正常低基础水平（体制性表达）。称低产AmpC酶染色体介导。（2）去阻遏不可逆的，Amp基因活化是不可逆转的即使停止使用药物也仍然持续产生容易跳到质粒上称持续高产AmpC酶。第40页,共71页，2024年2月25日，星期天分型及检测方法————略第41页,共71页，2024年2月25日，星期天●检测高产AmpC酶的意义

细菌一旦检测为高产AmpC酶，提示为多重耐药；对三代头孢菌素、及含酶抑制剂的复合抗生素治疗通常导致临床治疗失败；应选用碳青霉希类或第四代头孢或联合喹诺酮类（氨基糖苷类）治疗。第42页,共71页，2024年2月25日，星期天实验室对同一患者相同部位检出的同种病原菌，应每3-4天检测抗生素敏感性，以监测耐药机制产生（三代头孢S→R，头孢西丁S→R）专家系统药敏评注第43页,共71页，2024年2月25日，星期天碳青霉烯水解酶基本概念：碳青霉烯水解酶是指所有能明显水解碳青霉烯的β内酰胺酶，而不是单纯的“碳青霉烯酶”。第44页,共71页，2024年2月25日，星期天碳青霉烯水解酶的发现及流行特点：20世纪90年代初，日本发现质粒介导的金属酶-IMP-1，可在细菌之间转移。1996年日本17家医院的研究中发现，0.4%的铜绿假单胞菌带有IMP-1基因。不久在意大利的一株鲍曼不动杆菌和新加坡的一株肺克菌中也发现了该类酶。法国的一株铜绿假单胞菌中发现的质粒介导的金属酶VIM-2，与意大利一株铜绿假单胞菌中发现的VIM-1具有高度同源性，编码VIM-1的基因位于转座子上。近年来由于产ESBLS和AmpC酶的菌株增多引起碳青霉烯类抗生素的临床应用增加，可以预测世界其它地区亦可能出现产碳青霉烯酶菌株的流行。第45页,共71页，2024年2月25日，星期天什么是KPC酶？国内：已在肠杆菌科的多个菌属中有报道。肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌属、弗劳地柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌等。该类酶除阴沟肠杆菌可有染色体介导外，其他各类细菌均可为质粒介导，已成为临床治疗难题第46页,共71页，2024年2月25日，星期天碳青霉烯酶代表-KPC酶碳青霉烯酶，分子分类法(Amblar)的A组丝氨酸酶、功能分类法(Bush)的2f组，主要由质粒介导，其酶活性可受酶抑制剂抑制。可导致细菌对碳青霉烯类、青霉素类、广谱头孢菌素及单环类等抗生素的耐药性。KPC-1～KPC-4等4种。它们之间只有个别氨基酸发生了突变KPC-1、美国、1996年在一株对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌中发现，以后仅在几年时间内，已在美国、特别在美国的东北部各州蔓延，并造成局部地区暴发流行。第47页,共71页，2024年2月25日，星期天细菌一旦产生碳青霉烯酶临床治疗很困难第48页,共71页，2024年2月25日，星期天肠杆菌科细菌耐药机制ESBLs质粒型AmpC酶KPC碳青霉烯酶第49页,共71页，2024年2月25日，星期天肠杆菌科细菌中的KPC碳青霉烯酶可以水解碳青霉烯类(imipenem,ertapenemertapenem,meropenem,doripenem).主要发生在美国东部医院的ICU病房.肺炎克雷伯菌和其他的肠杆菌科细菌.常规的药敏试验方法不易检出，碳青霉烯类对这些细菌的MIC往往2μg/ml(仍然是敏感的)KPC酶可以水解广谱头孢菌素，因此所有对具有产ESBL酶的肠杆菌科细菌应该筛选碳青霉烯酶第50页,共71页，2024年2月25日，星期天如何检测碳青霉烯酶？产KPC酶的菌株用常规药敏试验不容易检出。可将厄他培南列为常规药敏试验的品种对所有具有ESBLs/AmpC酶样表型（即对第三、第四代头孢菌素耐药）的肠杆菌科细菌采用纸片法或MIC法（E-试验）进行厄他培南（和其他碳青霉烯类）的测定。如MIC为2或4μg/ml应视作有产KPC酶和其他碳青酶霉烯酶的可能。这时应与临床医师联系，并将该菌株送往参考试验室作进一步的研究。–改良的Hodgetest–PCR测定KPC酶第51页,共71页，2024年2月25日，星期天泛耐菌和多重耐药泛耐菌:如果该细菌对第3和4代头孢菌素,含酶抑制剂的复方制剂,碳青酶烯类,氟喹诺铜类和氨基塘甙类均耐药,但对多粘菌素敏感为泛耐菌.多重耐药菌:对5类药物中的一类或几类耐药为多重耐药菌.第52页,共71页，2024年2月25日，星期天临床常用抗菌药物β-内酰胺类抗生素√糖肽类-万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁√氨基糖苷类√大环内酯类√喹诺酮类药物√其它抗菌药-物磷霉素、多黏菌素链阳菌素等，抗真菌药第53页,共71页，2024年2月25日，星期天泛耐药菌株（PandrugResistantStrains）细菌：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌对常规药敏试验的药物均耐药哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、环丙沙星、阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南强力霉素和SMZ-TMP采取哪些措施菌株重新鉴定试验其它药物：多粘菌素/粘菌素敏感性试验或协同试验第54页,共71页，2024年2月25日，星期天

绿脓杆菌耐药机制膜通透性下降高产ampC酶;产ESBL;产金属酶泵出机制生物膜第55页,共71页，2024年2月25日，星期天铜绿假单孢菌铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。第56页,共71页，2024年2月25日，星期天不动杆菌的耐药机制对多种窄谱－内酰胺酶耐药由于TEM－1和CARB型－内酰胺酶对新型三代头孢菌素耐药是因为产大量染色体头孢菌素酶和超广谱的TEM酶第57页,共71页，2024年2月25日，星期天

不动杆中最主要的碳青霉烯酶是D类酶OXA-23、24、25、26、27、40、49、51、54、55、58、60该酶能水解亚胺培南、青霉素，但不水解三代头孢菌素.不动杆菌主要耐药机制第58页,共71页，2024年2月25日，星期天不动杆菌中还产IMP或VIM型金属酶，该酶水解底物范围广，包括碳青霉烯类、青霉素类和头孢菌素抗生素，不被克拉维酸等酶抑制剂抑制，但能被EDTA、2-巯基丙酸抑制

第59页,共71页，2024年2月25日，星期天革兰阴性菌革兰阳性菌ESBLsMRSAAmpCVISA与VRSAKPCVREPRSP耐药菌、细菌泛耐和多重耐药的监测工作必须靠临床医护人员和微生物检验工作人员携手，才能做好-加强沟通第60页,共71页，2024年2月25日，星期天小结1细菌耐药性产生是必然性、预防性2细菌的耐药机制多样性、常见的耐药机制3针对耐药性最好的治疗方法—个体化治疗4加强临床与实验室沟通非常重要第61页,共71页，2024年2月25日，星期天案例1临床患者：杨xx、男43岁、住院号7757492主诉：发热8天伴头痛入院时间：2008年2月18日5pm入院体温：39℃入院诊断：发热原因待查？入院检查:WBC3.2X109/L→2.4X109/L,HB140G/L→109G/LNEU52.5%,LY33.8%,MONO12.1%MP(-)CRP32.1mg/L尿RT,胸透均正常

第62页,共71页，2024年2月25日，星期天案例1临床诊断与鉴别诊断：1.感染性发热①细菌感染患者无细菌感染的临床症状与体征，血象及临床不支持②病毒感染发病初起为感冒样症状，流涕、鼻塞、