第三章常用生化检验技术

常用生物化学检验技术主讲：欧老师QQ:105165321目录1光谱分析技术2电化学分析技术3电泳技术4干化学分析及PCRContentsWelcomeback!Part01光谱分析技术案例导入

某患者，29岁，多饮、多食、多尿，消瘦，易感染，医生开检查申请单检测血糖。临床化学室用葡萄糖氧化酶法测血糖。现已测出标准管的吸光度为0.195，测定管吸光度值为0.390，已知标准管血糖浓度为5.55mmol/L，求测定管的血糖浓度。1、葡萄糖氧化酶法测血糖含量应用了什么技术和方法（光谱分析技术和比较法）？该技术基本原理是什么？如何正确使用该技术所需的仪器（分光光度计）？2、除用比较法测定血糖浓度外，还可采用什么方法（标准曲线法）？如何用该方法定量测定血糖浓度？3、该方法（标准曲线法）应注意哪些？案例分析第一节光谱分析技术利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析技术。光谱分析技术灵敏、准确选择性强快速、简便应用范围广生物化学检验中最基本和最常用的分析技术光谱分析技术分类光谱分析技术吸收光谱分析可见光及紫外分光光度法原子吸收分光光度法红外分光光度法发射光谱分析火焰光度法原子发射分光光度法荧光光谱法散射光谱分析散射比浊法透射比浊法第一节光谱分析技术一、吸收光谱分析法（一）分光光度法的基本原理

根据Lambert-Beer定律，当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成正比。入射光I0透射光I第一节光谱分析技术式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度。根据Lambert－Beer定律，当溶液层厚度单位为1cm，浓度单位为1mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数（ε）。ε是物质的特征性常数。在固定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。应用Lambert－Beer定律时必须符合3个条件：二是被测样品必须是均匀介质；应用Lambert－Beer定律时必须符合3个条件：三是在吸收过程中，吸收物质之间不能发生相互作用。一是入射光必须为单色光；11Lambert－Beer定律的偏离现象：溶液本身发生化学变化引起的偏离；仪器因素引起的偏离。溶液不是稀溶液时会引起偏离；非单色入射光会引起偏离；光的散射、折射引起的偏离；

(二)、分光光度计的基本结构最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计光源单色器比色杯检测器显示器五大部份结构：1、光源指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。

紫外光光度计常用氢灯作为光源。2、单色器定义：将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。种类：

滤光片棱镜光栅3、比色杯又称为吸收池或比色皿材料：常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成。

5、显示器4、检测器检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。

(三)、分光光度计的操作方法分光光度计的基本操作以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。2.将波长旋至测定的波长。3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为100.0。5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.0。6.重复步骤4和5。7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）。以F-722型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：1.接通电源，打开仪器工作开关，待显示屏出现“F-722”后触摸“CE”键，显示“YEA”；打开比色箱盖，触摸“0%T”显示“0.0～0.0”（记时），仪器预热20分钟；2.选择所需波长；3.将空白液、标准液、测定液分别倒入3个比色杯中，将比色杯依次放入比色箱中，使空白液对准光路。4.触摸“MODE”

键显示AE1

(触摸“0%T”显示A

E1)，合上比色箱盖，触摸“100%T”

显示“0.000”；5.将标准液、测定液推入光路，分别读取标准液、测定液吸光度As、Au数值。6.比色完毕，关闭电源，取出比色杯，合上比色箱盖，套上布罩，将比色杯洗净后倒置。7.计算:ATCu×CsAs=(四)吸光度的校正铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。22空白溶液的选择样品空白溶剂空白不显色空白平行操作空白试剂空白(五)空白溶液的选择当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色粒子时，选用空白溶剂参比。当样品基体溶液有颜色，而显色剂无颜色且显色剂也不与样品基体显色时，选用样品空白。当显色剂和被测试样均有颜色时，选用不显色空白与样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品溶液进行平行操作当显色剂或其它试剂有颜色，而被测试样中又无其他有色粒子时，选用试剂空白参比。23（六）分光光度法在生化检验中的应用1．对未知化合物进行定性分析2．对待测物质进行定量测定（1）标准曲线法（2）比较法（3）其它分析方法一、吸收光谱分析法（1）标准曲线法若将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度，即标准曲线法。标准曲线0.40.5020406080100浓度(g/L)吸光度0.30.20.1制作和应用标准曲线时应注意下面几点：①当测定条件发生变化时（如更换标准品、更换光电池或光源以及试剂批号不同时），标准曲线应重新绘制；②标准品应有高的纯度，标准液的配制必须准确；③当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定；④标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致；⑤标准溶液设置的浓度范围须足够大，应达到观察拐点。（2）比较法Cu=(Au×Cs)/As

己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：

其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。

（3）其它分析方法包括差示法、多组分混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。二、发射光谱分析法分子、原子或离子在辐射能的作用下，由基态或低能态跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱发射光谱（一）火焰光度法（二）荧光分光光度法28火焰光度法基本原理：指在一定条件下，以火焰作为激发源提供热能，使样品中待测元素原子化，由于原子能级的变化，产生特征的发射谱线。

火焰光度法临床应用：主要用于血清及尿液样品中钠、钾的测定特征辐射基态元素M激发态M*热能（火焰）

E二、发射光谱分析法固定荧光的发射波长而不断改变激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱。使激发光的波长和强度保持不变，不断改变荧光的发射波长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图称为荧光的发射光谱。荧光的激发光谱荧光的发射光谱荧光光谱基本原理：荧光是分子吸收光能量被激发后，从激发态的最低振动能级跃迁返回基态时所发射出的光。荧光光谱临床应用：大量具有生物意义的物质，都可采用荧光分光光度法进行分析测定，如氨基酸、蛋白质、核酸、酶和辅酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、维生素等。二、发射光谱分析法30三、散射光谱分析法利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法。散射光谱分析法（一）散射比浊法（二）透射比浊法31三、散射光谱分析法散射比浊法基本原理：一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关，光强度与复合物的含量成正比。透射比浊法基本原理：当光线通过一定体积的溶液时，由于溶液中存在颗粒（抗原－抗体复合物）对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，透射光的透光率和粒子的量成反比。通过测定透射光的透光率来反映粒子的量的方法即透射比浊法。Part02电化学分析技术电化学分析技术通过测量被测物质电化学参数（电动势、电导、电量）等物理量的变化，根据电化学参数与被测物质浓度之间的变化关系进行分析的方法。根据所测定电化学参数的不同电化学分析法分为：其中，电位分析法是最常用的一种仪器分析法。电化学分析法电位分析法测定原电池电动势以求物质含量的分析方法电导法

通过测定电阻以求物质含量的分析法电容量分析法借助某些物理量的突变作为滴定分析终点的指示电位分析法是利用测量原电池的电动势以求出被测物质含量，原电池是电位分析法的关键仪器，原电池的电动势为正极电极电势减去负极的电极电势。表示电极电位的基本公式是Nernst方程式。一、电位分析法用一个充满电解质的盐桥，将置有铜片的硫酸铜溶液与置有锌片的硫酸锌溶液连接起来。然后将铜片与锌片用导线连接，并在中间串联一个电流表。实验中观察到电流表指针发生偏转，说明这个装置是一种原电池。

负极反应(锌)：Zn-2e-→Zn2+正极反应(铜)：Cu2++2e-→Cu35二、电位分析法用到的电极有两种：指示电极和参比电极。电极电位随被测离子的浓度变化而改变的电极称为指示电极，如ISE。膜电极（离子选择性电极）：电极电位只与溶液中某种特定的离子(待测离子)浓度有关系，具有选择性响应。1、指示电极(工作电极)

参比电极是电极电位不随待测离子浓度的变化而变化的电极，即φ与C无关。常用的参比电极有：标准氢电极、饱和甘汞电极、银-氯化银电极.2、参比电极36电极电位测量：由于单个电极电位的绝对值无法测量，必须将ISE与参比电极共同浸入待测样品中组成一个原电池，通过测量原电池电动势（E电池）来测定EISE值。R为气体常数，T为绝对温度，n为离子电荷数，F为法拉第常数，ai为被测离子活度,当测定条件一定时，K可视为常数。原电池的电动势与被测离子活度的对数呈线性关系。下面来看看指示电极（工作电极）中最常见的ISE电极。三、电极电位的测量37ISE基本结构①电极腔体：玻璃或高分子聚合物材料做成；②内参比电极：通常为Ag/AgCl电极；③内参比溶液：由氯化物及响应离子的强电解质溶液组成；④敏感膜（电极膜）离子选择性电极分析法(ionselectiveelectrode，ISE)是电位分析法中发展最为迅速、最为活跃的分支。常用的离子选择性电极（ISE）玻璃膜电极敏感膜由玻璃材料制成，最常见为pH玻璃电极。气敏电极气敏电极是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。如氨气敏电极。酶电极酶电极是另一种敏化电极，其原理是将含酶的凝胶涂布于离子选择性电极的敏感膜上组成酶电极。举例：玻璃膜电极（酸度计）

pH计（酸度计）是一种专为使用玻璃电极测量溶液pH而设计的电子电位计是用以测定溶液PH值的仪器，也可以用来测量原电池的电动势。

它是将玻璃电极（指示电极）与饱和甘汞电极（参比电极）巧妙的组合在一起，插入待测溶液中之后就构成了原电池，经内部毫伏计测量的电动势转换成溶液的PH值,从显示器上就可以直接读出溶液的PH值。举例：酶电极（三诺血糖测定仪）举例：电极分析法在临床检验中的应用—电解质分析仪希莱恒HORRON电解质分析仪IMS-972C型奥迪康AUDICOM电解质分析仪

AC9900直接法指样品不经稀释直接由电极测量离子活度。优点是可采用全血测定，它迅速方便，结果准确，不会因血清中水体积所占比例的改变而影响结果。间接法指样品经一定离子强度缓冲溶液稀释后由电极测量离子活度。优点是样品用量少；由于样品预先进行稀释，不易堵塞管道；降低了血脂、不溶性蛋白质对电极的污染及损耗，使电极的寿命延长。四、样品测定方法：多发性骨髓瘤引起假性低血钠！

回顾临床资料近日一门诊患者，男，49岁。常规生化肝功、肾功、血糖、血脂、电解质检查，结果如下：总蛋白153.9g/L，白蛋白24.5g/L，球蛋白129.4g/L，电解质结果：钾4.4mmol/L、钠128.50mmol、氯102.8mmol/L、钙2.11mmol/L、磷1.55mmol/L、镁0.71mmol/L，提示高蛋白、低钠血症。既往史:既往“高血压病史”多年“脑梗塞”六年,规律服药。病程中:患者伴尿泡沫增多，偶有手足麻木针刺感,伴视物模糊，近一周体重下降4斤。多发性骨髓瘤（ＭＭ）是骨髓中浆细胞异常增生的恶性疾病，其能产生异常的单克隆免疫球蛋白，引起骨骼破坏、贫血、肾功能损害和免疫功能异常。IgG型最常见，该型可引起总蛋白异常增高。钾、钠、氯的测定在临床工作中常见两种方法：离子选择电极法直接法、离子选择电极法间接法。当采用离子选择电极法间接法测定钾、钠、氯时，导致出现低钠血症的原因是总蛋白异常增高，是一假性低钠血症。原因在于：离子选择电极只对水相中活化离子产生选择性响应，与标本中脂肪、蛋白质所占体积无关。【血浆中固体物质部分（血脂和蛋白质）约占总体血浆的7%，而水相占93%，电解质都存在于水相中】离子选择电极法间接法检测时需要用样本稀释液来稀释样本，由于总蛋白占有大量体积，从而使结果出现假性降低。离子选择电极法直接法不需要样本稀释，不受高蛋白、高脂样本的影响。该案例带给我们的启示：对全自动生化仪采用离子选择电极法间接法进行检测钾、钠、氯的，报告审核环节需注意：对于脂血样本（常见于急性胰腺炎患者）高蛋白样本（常见于多发性骨髓瘤及巨球蛋白血症患者），如果能换用离子选择电极法直接法进行检测的，必须重新检测，用直接法结果发出报告。

若仅必须使用离子选择电极法间接法，须在备注中注明：高脂样本或高蛋白样本使检测结果低于真实值。每一张检验报告,背后都有患者渴望的眼神

看似简单的检验数字,背后都有纷繁复杂的世界

解读数字背后的故事，探寻患者疾病的真相!

在帮助患者中实现检验知识和职业价值!Part03电泳分析技术电泳分析技术电泳现象发现于1807年，直到1937年才得到应用。1937年瑞典的Tiselius创造了Tiselius电泳仪，最早建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法。1950年Durrum用纸电泳进行了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳。1967年，Tiselius的学生将电泳转移到玻璃管中,利用其较大的比表面积有助于散热的特点，有效地减少焦耳热的不利影响，有力推进了电泳向毛细管电泳方向发展。80年代出现新的毛细管电泳技术。由90年代至今，电流分析仪的最大变化特点为自动化程度日益提高，应用领域大大增加。一、电泳分析技术的基本原理溶液中带电粒子在电场中定向移动的现象称为电泳。电泳利用电泳现象对物质进行分离的技术叫电泳技术。电泳技术电泳技术的基本原理物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。血浆中蛋白质分子的等电点约为4.7左右。如果让其带电，就能进行电泳了。(一)蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的等电点（pI）：如果在某一pH值溶液中，蛋白质所带的正负电荷相等，即蛋白质的净电荷为零，蛋白质电离为兼性离子时，该溶液的pH值称为该物质的等电点。粒子的荷电量可以通过调节pH值与pI之间的差值加以控制，差值越大，粒子荷电量越多。(二)电泳迁移率电泳迁移率是指在单位电场强度时带电粒子的迁移速度.迁移率与带电粒子所带净电荷成正比，与粒子的大小和缓冲液的粘度成反比。如果用醋酸纤维素薄膜做载体，将蛋白质置于pH8.6的缓冲溶液中电泳，血浆蛋白质都会带上负电荷，由于它们的等电点不同，所带电荷量也不同，各种蛋白质的分子量亦不相同，所以在同一电场中电泳迁移率就有差异。带电粒子由于各自的电荷和形状大小不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。血清蛋白等电点电泳迁移率（cm2/s·V）清蛋白4.845.9×10-5α1-球蛋白5.065.1×10-5α2-球蛋白5.064.1×10-5β-球蛋白5.122.8×10-5γ-球蛋白6.85~7.301.0×10-5血清蛋白等电点和电泳迁移率血清蛋白质分子的电泳迁移率有差异,在电泳过程中就可以被分离。电泳时可将血清（浆）蛋白质分成分为五条区带，从正极到负极依次为白蛋白和α1、α2、β、γ-球蛋白，白蛋白跑得最快，含量高，染色颜色最深，γ-球蛋白跑得最慢，α1区带染色最浅。血清醋酸纤维素薄膜电泳操作1、准备

薄膜切成1.5×7.5cm大小，浸入巴比妥缓冲液，待完全浸透（约20分钟），取出，滤纸吸去多余缓冲液。2、点样无光泽面1.5cm处，用加样器取血清2～3微升加一细而直的加样线。3、电泳薄膜点样端置阴极，平整贴于电泳槽支架上，平衡5分钟，电压100～160V，电流0.4～0.6mA/cm膜宽，通电40～50分钟，使电泳区带展开约3～5cm即可关闭电源。4、染色取出薄膜，浸入染色液中染色2分钟，然后取出，浸入漂洗液中漂洗数次，直至背景颜色脱净为止。5、结果得五条区带，从阳极端起，依次为ALB、α1、α2、β和γ-球蛋白。6、定量（1）洗脱比色法（2）光密度计扫描法清蛋白（Alb）：57％～68％、35～52g/L；α1-球蛋白：1.0％～5.7％、1.0～4.0g/L；α2-球蛋白：4.9％～11.2％、4.0～8.0g/L；β-球蛋白：7％～13％、5.0～10.0g/L；

r-球蛋白：9.8％～18.2％、6.0～13.0g/L。参考值几种典型的电泳图谱及扫描图正常人；B．肾病综合症；C．肝硬化（典型β-γ桥）；D．肝硬化（不典型β-γ桥）；E．多发性骨髓瘤（IgG型）；F．多发性骨髓瘤（IgA型）影响因素分子的形状与性质球形移动速度快纤维状移动速度慢电场强度高电场强度,电泳速度加快，电流强度也增大，产热增多低电场强度,电泳速度减慢。电泳时间增长，增加了标本的扩散电泳缓冲液pH值:一般设在4.5～9.0为宜缓冲溶质:化学性质稳定、缓冲容量大、电导率低、离子移动性好离子强度:缓冲液的导电能力,以0.05～0.1mol/L为宜支持介质吸附作用：吸附作用可阻滞标本的移动，出现区带拖尾现象电渗作用：电场中液相对固相的相对移动称为电渗蒸发(三)影响电泳的因素支持介质的电渗作用二、常用电泳分析技术及应用按电泳方式分类移动界面电泳区带电泳稳态电泳BEAF以醋酸纤维素薄膜作为支持介质的一项电泳技术以琼脂糖凝胶作为支持介质的一项电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一项电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳醋酸纤维素薄膜电泳等电聚焦电泳按电泳支持物分类二、常用电泳分析技术及应用优点：醋酸纤维素几乎不带电荷，吸附作用和电渗作用都很微弱；分辨率高，区带清晰；不吸附染料，区带周围染料可完全漂洗干净；极易透明，便于区带扫描定量；透明后的薄膜易于干燥，电泳区带可长期保存。缺点：吸水性较差，较脆，电泳时水分容易蒸发。因此要求电泳槽密闭性能要好，始终维持水蒸气饱和，电流强度不宜过大，一般保持在0.4~0.6mA/cm宽为宜。1.醋酸纤维素薄膜电泳2.琼脂糖凝胶电泳优点：琼脂糖凝胶透明度好，便于区带扫描。适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化，在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测缺点：电泳完毕后区带易扩散，可及时固定。3.聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：1.既有电荷效应又有分子筛效应，分离效果好。2.化学稳定性高，是一种稳定的亲水胶体。3.几乎没有吸附和电渗作用。4.机械强度好，无色透明，可直接光密度扫描。5.可调节凝胶孔径以适合不同分子量的分离。4.等电聚焦电泳是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）优点：IEF是一种简便、快速、高效的分离分析方法，特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等的分离分析，能够满足组分定量、杂质检出、质量控制、临床诊断等方面的要求。(三)电泳区带的测定电泳区带的定性、定量测定直接法用紫外光扫描仪直接扫描电泳区带染色法将电泳区带用染料染色，洗脱背景，然后将区带一一剪下用溶剂洗脱比色（三）电泳技术在临床检验中的应用血清蛋白电泳1尿蛋白电泳2血红蛋白电泳3糖化血红蛋白电泳4免疫固定电泳5同工酶电泳6三、自动电泳仪分析技术自动电泳仪分类全自动荧光/可见光双系统电泳仪全自动醋纤维膜电泳仪全自动琼脂糖电泳仪自动电泳仪的电泳过程，包括加样→迁移→染色→去色→烘干都依次按程序自动进行。Part04干化学分析技术干化学分析技术指将液态样品如血浆、血清、尿液等置于含有试剂的固相载体上发生反应，依照反应结果定量测定样品中特定成分的浓度或活度的一项技术。干化学分析是一种专门使用固相载体试剂进行临床化学检验的分析仪，它通过反射光度法、差示电位法等方法定量测出样品中特定成分的浓度或活度。。干化学分析仪72干化学技术普遍采用多层膜固相试剂技术，即干式化学的多层膜试剂载体，它集中现代化学、光学、酶工程学、化学计量学和计算机技术于一体，已使其作为定量方法。干化学分析技术干式化学的多层膜试剂载体

基于反射光度法的多层膜基于差示电位法的离子选择电极的多层膜基于荧光技术和竞争免疫技术的荧光反射光度法多层膜一、干化学分析技术的基本原理73理论基础：遵从Kubelka-Munk理论光反射率与固相层的厚度、单位厚度的光吸收系数以及固相反应层的散射系数有关系，当固相层厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数同待测物的浓度成正比。（一）反射光度法74多层膜干片结构（1）样本扩散层（2）反射层（3）辅助试剂层（4）试剂层（5）透明支持层基于反射光度法的多层膜干片结构示意图反应过程演示比色展开层试剂层显色层支持层接收器以血氨测定为例，氨干试剂片的有效成分是溴酚蓝,其它成分包括表面活性剂、缓冲成分和保湿剂。氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料溴酚蓝反应产生颜色产物，其颜色强度也即吸光度与样品中氨含量成正比，由反射光度计在605nm进行吸光度检测，与经同样检测的氨校准品进行比较，得到样品中氨的浓度。血氨测定的分析参数很简单：样品10μl，反应时间5min，波长605nm。基于传统湿化学分析的离子选择电极原理，用于测定无机离子。（二）差示电位法多层膜结构（1）离子选择性敏感膜（2）参比层（3）氯化银层（4）银层（5）支持层79干化学自动分析仪已广泛应用于检验医学的各个方面，检测的项目已多达70余项，包括常规生化、内分泌激素、毒素、药物浓度分析以及特种蛋白等免疫学检验。干化学分析仪的分类反射光度法系统胶片涂层技术分析系统袋式分析仪二、干化学分析技术在临床检验中的应用80干化学分析法的特点：速度快，灵敏度和准确度与典型的分离式仪器相近；应用Lambert－Beer定律时必须符合3个条件：超微量，操作简单，占用空间小，使用过程中灵活机动性强。脱离了传统的分析方法，所有的测定参数均存储于仪器的信息磁场块中；81区别点干化学湿化学试剂固相，大多无需定标，稳定周期长（数月），全血可直接上机检测液体，需要定标，稳定周期短，全血不可直接上机检测仪器磁卡校正，无需排水系统，分析前后无需清洗每次测试原则上需要校正，需要排水系统，测试前后需清洁反应载体固相介质反应杯检测方法反射光度法透射光度法电解质测定差示电位法离子选择性电极法理论基础Kubelka-Munk理论和Williams-Clapper公式Lambert-Beer定律干化学和湿化学生化检测的主要区别821.仪器监测2.校准频度3.质控物4.干片试剂的储存与使用5.工作环境温度和湿度三、干化学分析技术的影响因素Part05基因扩增技术案例导入

检验荔枝DNA找到杀人者：一个年仅12岁的女孩，失踪数日后，在村边的臭水沟中被人发现尸体。侦查人员在死者胃里发现了一种呈咖啡色的肉丝状物质，随后又在嫌疑人家中发现了一些发霉的荔枝壳和荔枝核，两者之间究竟有无关联？检验人员运用DNA检验技术，采用多对引物进行扩增检验，结果证明在死者胃内发现的咖啡色肉丝状物质就是荔枝肉。

检验进一步证明，死者胃内所发现的荔枝肉和嫌疑人家中发现的荔枝壳具有同一来源的特性，在所有的引物扩增检验结果中，果肉和外壳都呈现出相同的DNA谱带。同时，警方从市场上随机购买的荔枝却与前两者的DNA谱带不同。这个结果说明一个事实，在死者胃内发现的荔枝肉与在嫌疑人家中发现的荔枝壳是同一棵树上结的果实，具有同一性。在证据面前，嫌疑人供认了犯罪过程。案例分析1、DNA检验技术主要包括哪些技术？2、如何分离DNA？3、诊断分子生物学技术在临床有哪些运用？如何使用PCR扩增仪扩增DNA？第五节基因扩增技术聚合酶链反应（PCR）：又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法。能使人们在几小时内从试管中获得大量的特异的核酸片段。临床实验室主要用于对病毒、细菌、支原体及其它病原体的检测。一、PCR反应基本原理PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA的复制基本相似。每一次循环复制包括3个步骤：

1.变性2.退火3.延伸2.退火（annealing）即在较低的温度(40~70℃)下使加入的引物与待扩增的DNA区域特异性结合，以提供DNA复制起始的3’-OH端。3.延伸（extension）即在适当的温度下（70℃～75℃），DNA聚合酶特异性结合到DNA模板上的引物的3’-OH端，以dNTP为反应原料，以靶序列为模板，根据碱基互补配对原则，进行DNA链的延伸，即合成DNA新链。1.变性（denature）通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成DNA单链模板而游离于反应体系中，此过程称为变性。