小鼠和猪后肠微生物群落对两种类型日粮纤维的响应规律研究

小鼠和猪后肠微生物群落对两种类型日粮纤维的响应规律研究本研究首先以BALB/c小鼠为研究对象,在其饲粮中短期添加可溶性日粮纤维(solubledietaryfiber,SDF)燕麦β-葡聚糖、不可溶性日粮纤维(insolubledietaryfiber,IDF)微晶纤维素(MicrocrystallineCellulose,MCC)及二者混合物,考察这两种类型日粮纤维(dietaryfiber,DF)对小鼠粪便和结肠微生物群落结构的影响,并探索小鼠后肠特异性利用两种DF的核心菌群。其次以生长猪为研究对象,通过在体交叉试验,探讨猪后肠细菌和产甲烷菌群落分别对这两种纤维的动态响应过程和潜在互作关系。试验一高水平SDF和IDF对小鼠生长性能、器官指数及后肠微生物群落结构的影响采用单因子试验设计,将36只6周龄健康BABL/c雄性小鼠(17.95±0.95g)按体重无差异原则随机分为4组。对照组(C组)小鼠饲喂基础饲粮,不额外添加DF;微晶纤维素组(MicrocrystallineCellulose,MCC;M组)饲粮中添加20%MCC(纯度≥99%);β-葡聚糖组(G组)饲粮中添加28%燕麦β-葡聚糖(纯度为70%);混合组(GM组)饲粮中添加14%燕麦β-葡聚糖和10%MCC。各组饲粮营养水平保持基本一致。试验期为21天。结果表明:1.饲粮中添加高水平DF(绝对浓度约为20%)显著降低小鼠平均日采食量(ADFI,P<0.01),表现为C组>1M组>GM组>G组;各组小鼠体增重差异不显著(P>0.05)。GM组小鼠附睾脂肪垫重量显著高于G组和M组小鼠(P<0.05);2.G组和GM组小鼠结肠食糜乙酸含量有高于M组和C组的趋势(P<0.1),其中G组高于C组65%,高于GM组52%;G和GM组小鼠结肠中丙酸含量极显著高于M组和C组(P<0.01),其中G组高于C组75%,高于GM组71%。4.PCR-DGGE(变性凝胶梯度电泳)分析结果表明,第4天,G组小鼠后肠细菌多样性显著低于C组(P<0.05);第7天,G组小鼠粪便细菌多样性极显著低于其他组(P<0.01);第10天,M组小鼠粪便细菌多样性显著高于G组和GM组(P<0.01);5.高通量测序结果表明,G组小鼠结肠食糜中Bacteroidetes门相对丰度显著高于其余三组(P<0.01),M(P=0.03)和GM组(P=0.02)该菌相对丰度显著高于C组(12.9±4.2%)。C组小鼠结肠食糜中Firmicutes门相对丰度最高(80.1±4.8%),G组小鼠结肠中该菌相对丰度(38.7±14.8%)极显著低于其余组(P<0.01)。6.G组小鼠结肠中β-proteobacteria和γ-proteobacteria的相对丰度极显著高于其余组(P<0.01),但δ-proteobacteria的相对丰度极显著低于其余组(P<0.01)。G组小鼠结肠中Enterobacteriaceaae相对丰度极显著高于其余组(P<0.01)。7.小鼠结肠中与SDF利用有关的菌群以Bacteroidsspp.、Oscillospiraspp.、Prevotellaspp.和Ruminococcusspp.为代表;与IDF利用有关的菌群以Oscillospiraspp.、Ruminococcusspp.、Desulfovibriospp.、Coprococcusspp.和Bacteroidesspp.为代表。8.qPCR分析表明,硫酸盐还原菌(SRB)的数量在G组小鼠结肠中显著低于其余组,而在M组和GM组小鼠结肠中最高(P<0.01),但4组小鼠结肠中产甲烷菌的mcrA基因绝对拷贝数无显著差异(P>0.05)。结果提示:小鼠后肠存在特异性利用SDF和IDF的核心菌群;后肠细菌发酵SDF产生更多SCFAs(尤其是丙酸和乙酸),可能通过直接供能和糖异生途径为机体平衡由采食量降低引起的体重和能量损失。试验二猪后肠微生物群落对日粮纤维类型转变的响应规律选择16头健康的DLY(杜洛克×长白×大约克)生长期阉公猪(40.38±1.19kg),按体重无差异原则随机分为2组。正式试验分为4个阶段,第一阶段为期1周,之后每个阶段持续3周。DF添加物同试验一。采用交叉试验设计:第一阶段所有猪只均饲喂基础饲粮;第二阶段处理1(T1)组饲粮中含7.14%燕麦β-葡聚糖,处理2(T2)组饲粮中含5%MCC;第三阶段T1组饲粮中的燕麦β-葡聚糖替换为5%MCC,T2组饲粮中的MCC替换为7.14%燕麦β-葡聚糖;第三阶段所有猪只均饲喂基础饲粮。日粮中燕麦β-葡聚糖和MCC的绝对浓度为5%。在第二、三、四阶段的第三周进行为期4天的消化试验。所有饲粮营养水平保持基本一致。试验期间每隔两天采集一次直肠内容物,换料时连续采集三天直肠内容物。结果表明:1.T2组由IDF饲粮转换为SDF饲粮后,试猪ADFI极显著低于T1组(P<0.01)。2.纤维类型显著影响粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash),粗纤维(CF)和酸性洗涤纤维(ADF)的表观消化率。与采食IDF饲粮的猪只相比,采食SDF饲粮的猪只CP、EE、Ash表观消化率显著降低(P<0.05),且CF和ADF表观消化率极显著升高(P<0.01)。3.PCR-DGGE分析表明,猪后肠细菌对SDF和IDF两种DF的实时动态响应过程呈现相反趋势。采食含SDF饲粮的猪只后肠细菌多样性呈降低趋势,与第7天(Shannon指数为3.51±0.18)相比,第28天Shannon指数(3.32±0.09)显著降低(P<0.01),β多样性指数呈上升趋势;采食含IDF饲粮的猪只后肠细菌多样性呈上升趋势,与第7天(3.25±0.08)相比,第28天Shannon指数(3.57±0.10)显著升高(P<0.01),β多样性指数呈下降趋势。4.当饲粮纤维类型由IDF转变为SDF时,猪后肠细菌和产甲烷菌群落的响应更敏感,细菌多样性出现明显波动。第29、31、40和49天细菌Shannon指数分别为:3.62±0.12、3.12±0.09、3.47±0.06和3.15±0.09(P<0.01);产甲烷菌多样性呈现明显的先上升后下降趋势,d29,d31,d43,d49Shannon指数分别为2.77±0.15、2.80±0.09、2.96±0.09和2.55±0.10(P<0.01)。5.高通量测序分析表明,采食含SDF饲粮的猪只后肠Firmicutes门细菌相对丰度从73%(d7)迅速升至82%(d8)之后逐渐降至68%(d22),Bacteroidetes相对丰度则表现出相反的变化趋势:从17%(d7)迅速降低6%(d8),之后升至19%(d22)。采食含IDF饲粮的猪只后肠Firmicutes相对丰度则由81.99%(d7)降至63.33%(d22)然后略微回升(71.02%,d28)。6.LefSe(线性判别分析)结果表明,T1组第2阶段猪后肠差异菌群分属于Actinobacteria和Firmicutes门,且含有糖降解相关菌群,如Mitsuokella、Ruminococcaceae、Megasphaera等。T1组第3阶段含有的差异菌群种类较多,分属于Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes门,可鉴定的差异菌属包含Sharpea、Epulopisium、Clostridium等。与其余时间点样本相比,T1组第51天样本(试验第4阶段)中含有的差异菌群种类最多,分属于Lentisphaerae、Proteobacteria、Bacteroidetes、ProteobacteriaFirmicutes门;T2组试验第2阶段差异菌群分属于Baacteroidetes、Firmicutes和Chlamydia门,第3阶段差异菌群分属于Firmicutes和Spirochaetes门,而在试验第51天时,样本中的差异菌群分属于Proteobacteria、Lentisphaerae、Verrucomicrobia、Bacteroidetes和Firmicutes门。结果提示:猪后肠存在特异性利用SDF和IDF的菌群;当DF类型改变,与产甲烷菌相比,细菌群落结构变化更为剧烈;摄入SDF和IDF的先后顺序明显影响细菌和产甲烷菌群落结构;产甲烷菌群落结构的变化晚于细菌,暗示二者在不同类型DF的后肠发酵过程中存在复杂的交互饲喂关系;菌群结构的变化可