Orexin双受体拮抗剂Suvorexant对APPPS1小鼠昼夜节律紊乱及认知行为损伤的改善作用及机制研究

Orexin双受体拮抗剂Suvorexant对APP/PS1小鼠昼夜节律紊乱及认知行为损伤的改善作用及机制研究目的:观察orexin双受体拮抗剂suvorexant慢性预处理能否有效改善9月龄APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)模型小鼠的行为昼夜节律紊乱和多种认知功能损伤,并探讨其在AD病程中发挥神经保护作用的可能机制。方法:1.动物分组及给药将8月龄雄性APP/PS1和相同遗传背景的野生型(wildtype,WT)对照C57BL/6小鼠随机分为4组:APP/PS1-Vehicle(APP/PS1-Veh)、APP/PS1-Suvorexant(APP/PS1-Suv)、WT-Vehicle(WT-Veh)和WT-Suvorexant(WT-Suv),每组15-20只。每日在光照期开始(ZT0)时,通过口服灌胃给予suvorexant(30mg/kg)或等体积的vehicle(0.5%甲基纤维素400),连续给药28d。2.跑轮行为学实验首先设置实验条件为12h光照:12h黑暗(light-dark,LD)环境,即6:00开灯,18:00关灯,开灯期间光照强度为360Lx。所有小鼠先适应1周,然后在LD环境中连续记录28d,之后转入持续黑暗(constantdark,DD)环境,再继续记录14d。跑轮实验结束后,对小鼠的活动量进行统计分析,并使用Actiview和Clocklab分析软件根据跑轮原始数据对LD和DD环境下小鼠的周期(period)、活动持续时间(activityduration)、鲁棒值(robustness)、振幅(amplitude)及昼夜变异性(intradailyvariability,IV)进行分析,以衡量其运动的昼夜节律性及稳定性。3.认知行为学实验(1)Y迷宫自发交替实验:将小鼠置于Y迷宫中心区域,并使其自由探索迷宫8min,记录各组小鼠的进臂总次数及进臂顺序,计算自发交替正确率。(2)Morris水迷宫实验:包括定位航行实验、空间探索实验和可视平台实验,在Y迷宫实验结束后第二天开始。第1-5天为定位航行实验,记录各组小鼠寻找水下平台的逃避潜伏期和游泳轨迹;第6天在空间探索实验中记录小鼠在目标象限的游泳时间和轨迹,并计算其在目标象限的游泳时间百分比;随后进行可视平台实验记录小鼠到达可视平台的时间,此外还记录小鼠在6天实验中的游泳速度。4.在体海马LTP记录行为学实验结束后,小鼠用5%水合氯醛(0.007ml/g)腹腔注射麻醉并固定于脑立体定位仪,根据脑立体定位图谱将绑定的刺激和记录电极插入小鼠海马Schaffer侧枝-CA1区突触传递通路。在测试刺激下记录场兴奋性突触后电位(fieldexcitatorypostsynapticpotential,fEPSP)30min,配对脉冲刺激记录双脉冲易化(paired-pulsefacilitation,PPF),高频刺激(highfrequencystimulation,HFS)诱导长时程增强(long-termpotentiation,LTP),并连续记录60min。5.冰冻切片免疫组织化学实验每组随机取3只小鼠,灌注、固定、取脑,利用冰冻切片的方法制备厚度为10μm的脑片,一抗6E104°C孵育过夜,二抗孵育2h,DAB显色30min,苏木素复染细胞核,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。利用光学显微镜观察并比较各组小鼠下丘脑视交叉上核(suprachiasmaticnucleus,SCN)、海马及皮层组织Aβ(6E10)斑块的面积。6.Westernblot实验每组在ZT2(光照期)和ZT14(黑暗期)分别取5-6只小鼠5%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头、取脑,分别从SCN组织和海马组织提取蛋白进行浓度测定,上样、电泳、转膜,5%胎牛血清(BSA)封闭,一抗4°C孵育过夜,二抗室温孵育,ECL发光液曝光,运用AlphaViewSA软件分析SCN组织的PER1蛋白,海马组织的PER1、CREB及pCREB蛋白的表达量。结果:1.Suvorexant减轻APP/PS1小鼠的行为昼夜节律紊乱。在LD环境中,APP/PS1-Veh组小鼠的日均活动量明显低于WT-Veh组(P=0.002),尤其是在黑暗期的ZT12-ZT24平均活动量显著降低(P=0.003)。Suvorexant预处理后,APP/PS1小鼠的日均活动量有所上升,但与APP/PS1-Veh组相比无统计学差异(P=0.071)。同时,与WT-Veh组小鼠相比,APP/PS1-Veh组小鼠的相对振幅(P<0.001)和鲁棒值(P<0.001)显著降低,昼夜变异性(IV)明显增高(P<0.001);suvorexant预处理后,APP/PS1小鼠的相对振幅(P=0.001)和鲁棒值(P=0.003)均明显升高,IV明显降低(P<0.001)。以上结果表明,APP/PS1小鼠在LD环境下的昼夜节律稳定性出现损伤,suvorexant提高了APP/PS1小鼠的昼夜节律稳定性,减轻了其昼夜节律紊乱。转入DD环境后,APP/PS1-Veh组小鼠在主观白天出现散在活动,自由运转周期明显长于WT-Veh组小鼠(P<0.001);suvorexant预处理后,APP/PS1小鼠的自由运转周期明显缩短(P=0.021)。同时,APP/PS1-Veh组小鼠的日均活动量明显减少(P=0.003),在主观白天CT0-CT12的平均活动量显著高于WT-Veh组(P=0.031),在主观夜间CT12-CT24的平均活动量明显低于WT-Veh组(P=0.002);给予suvorexant预处理后,APP/PS1小鼠的日均活动量(P=0.073)和CT12-CT24的平均活动量(P=0.061)有所上升,但与APP/PS1-Veh组相比无统计学差异。此外,与WT-Veh组小鼠相比,APP/PS1-Veh组小鼠的活动持续时间明显延长(P<0.001),相对振幅(P=0.004)和鲁棒值(P=0.005)显著下降,IV明显增高(P<0.001);而suvorexant预处理缩短了APP/PS1小鼠的活动持续时间(P<0.001),增大了相对振幅(P=0.004),减小了IV(P<0.001),鲁棒值增大但无统计学差异(P=0.051)。以上结果证明,APP/PS1小鼠在DD环境中的昼夜节律稳定性出现损伤,suvorexant预处理增强了APP/PS1小鼠昼夜节律的稳定性,部分减轻了APP/PS1小鼠的昼夜节律紊乱。2.Suvorexant减轻APP/PS1小鼠的认知功能损伤。在Y迷宫自发交替实验中,APP/PS1-Veh组小鼠的自发交替正确率明显低于WT-Veh组(P=0.001)和APP/PS1-Suv组小鼠(P<0.001)。在Morris水迷宫定位航行实验的第2-5天,APP/PS1-Veh组小鼠寻找水下平台的逃避潜伏期明显长于WT-Veh组小鼠(day2-5:P<0.001),suvorexant预处理后APP/PS1小鼠的逃避潜伏期缩短(day2:P<0.01;day3-5:P<0.001)。在第6天的空间探索实验中,suvorexant显著延长了APP/PS1小鼠在目标象限中的游泳时间百分比(P=0.005)。同时,各组小鼠在6天实验中的游泳速度,以及在可视平台实验中到达平台的游泳时间均无统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,suvorexant预处理可以有效减轻APP/PS1小鼠的短期工作记忆和长时程空间学习记忆能力损伤。3.Suvorexant减轻APP/PS1小鼠的海马LTP压抑。在体海马场电位记录实验发现,4组小鼠在HFS前30min的基础fEPSPs斜率和配对脉冲刺激诱导的PPF均无统计学差异(P>0.05),表明APP/PS1基因突变以及suvorexant预处理均未影响小鼠的基础突触传递和突触前神经递质的释放。给予HFS后,四组小鼠均成功诱导出LTP,但随着记录时间延长,APP/PS1-Veh组小鼠的fEPSP斜率逐渐下降。APP/PS1-Veh组小鼠在HFS后30min(P<0.001)和60min(P<0.001)的fEPSP斜率均显著低于WT-Veh组,而suvorexant预处理后APP/PS1小鼠的fEPSP斜率明显增加(30min:P=0.015;60min:P<0.001)。4.Suvorexant减少APP/PS1小鼠海马及皮层组织的Aβ斑块沉积。四组小鼠均未在SCN区检测到6E10阳性的Aβ斑块,但9月龄APP/PS1组小鼠的海马及皮层均有明显的Aβ斑块沉积。Suvorexant预处理后,APP/PS1小鼠海马及皮层组织Aβ斑块阳性面积明显减少(P<0.001)。5.Suvorexant恢复APP/PS1小鼠SCN和海马区PER1及pCREB蛋白表达的昼夜节律性。WT-Veh组小鼠SCN(P<0.001)和海马区(P=0.008)PER1蛋白的表达均有明显的昼夜节律性,白天ZT2表达水平较高,夜间ZT14表达水平较低;海马区PER1下游的pCREB蛋白表达则表现出ZT2下降而ZT14升高的昼夜节律性(P=0.002)。APP/PS1-Veh组小鼠的SCN脑区(P=0.737)及海马区(P=0.225)均丧失了PER1蛋白表达的昼夜节律性,海马区pCREB蛋白的表达也丧失了昼夜节律性(P=0.052);suvorexant预处理后部分恢复了APP/PS1小鼠SCN区PER1蛋白的昼夜节律性表达(P=0.054),恢复了