巴伦葛兹类芽孢杆菌和米黑根毛霉的几丁质酶生化性质研究

巴伦葛兹类芽孢杆菌和米黑根毛霉的几丁质酶生化性质研究几丁质酶在生物防治、生物质转化和功能性低聚寡糖生产等领域具有广大的运用,一直受到高度关注。巴伦葛兹类芽孢杆菌是一株嗜热海洋细菌,以几丁质作为诱导物时能分泌多种胞外几丁质酶。本文主要研究和讨论了产几丁质酶微生物的筛选及鉴定,发酵条件优化,以及天然几丁质酶的纯化和生化性质。此外,还研究了两种重组几丁质酶的克隆表达、性质及相关应用,论文主要结论如下:（1）从中国南海海水样中筛选获得一株高产几丁质酶的细菌CAU904,通过形态学观察、16SrDNA序列比对及生理生化实验鉴定为巴伦葛兹类芽孢杆菌（Paenibacilusbarengoltzii）。使用不同的碳源、氮源、温度、初始pH、表面活性剂以及发酵时间的单因素优化试验取得最佳发酵条件为:0.5%（w/v）胶体几丁质,0.2%（w/v）酵母浸提物,0.1%（w/v）吐温-80,发酵培养基初始pH为7.0,45℃下培养72h。其最优发酵产酶条件在优化后发酵条件下,巴伦葛兹类芽孢杆菌最大产酶水平提高至8.2UmL-1,比优化前提高了5.4倍。几丁质酶的酶谱结果分析显示,该菌株可以产生多达11种几丁质水解活性的同工酶。从巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904发酵酶液中纯化获得一个分子量为67.0kDa的几丁质酶,命名为PbChi67,该酶属于糖苷水解酶第18家族。其最适pH为3.5,且在较宽广的pH范围内稳定;最适反应温度为60℃,具有较好的热稳定性。该酶具备严格的底物特异性,只对几丁质类底物存在活性。其水解几丁质聚合物最终产物为几丁单糖及几丁二糖,表明该酶为内切型的几丁质酶。（2）从巴伦葛兹类芽孢杆菌中克隆到一个18家族几丁质酶基因（PbChi74）。该序列含有一个2,163bp的开放阅读框,编码720个氨基酸。通过Ni-IDA亲和层析一步纯化得到电泳级纯蛋白,纯酶的分子量为74.6kDa。PbChi74的最适温度为65℃,在60℃条件下保温30min仍然稳定。在65、70、75和80℃下的半衰期分别为211.7、144.0、79.7和35.2min,最适pH为4.5,在pH4.0-9.0范围内稳定。而且该酶具有良好的底物特异性,可以有效降解胶体几丁质和乙二醇几丁质,比活力分别为19.9Umg-1和22.2Umg-1PbChi74还能够降解pNP-NAG底物,比酶活力达到6.4Umg-1,表明该酶同时具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性。几丁质酶PbChi74水解特性表明水解初期只有几丁二糖产生,显示PbChi74为外切型几丁质酶。PbChi74还能水解几丁寡糖（聚合度2-5）,水解终产物均为N-乙酰氨基葡萄糖。当几丁质酶PbChi74与-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase）协同水解胶体几丁质时,几丁单糖由最初的11.3mgmL-1增加至27.8mgmL-1。HPLC检测到N-乙酰氨基葡萄糖为唯一的酶解产物,此时转化率达到92.6%。胶体几丁质经过酶法水解,生物转化获得的N-乙酰氨基葡萄糖产率达到86.1%。（3）从嗜热真菌米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）CAU432中克隆获得一个新型几丁质酶基因,命名为RmChi44。基因RmChi44含有一个1,284bp的开放阅读框,编码427个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与来源于绿僵菌（Metarhiziumacridum）（M.a.XP₀07810721）的糖苷水解酶18家族几丁质酶相似性最高,为50%。RmChi44在大肠杆菌中成功表达,经过Ni-IDA一步纯化获得纯酶,纯化倍数为3.3,回收率为40.9%。SDS和凝胶色谱柱检测到蛋白分子量分别为44.6kDa和44.7kDa,表明该酶天然状态下为单亚基蛋白。酶学性质测得该酶的最适pH为4.5,最适温度为50℃。底物特异性测定显示能够降解胶体几丁质和乙二醇几丁质,对pNP-NAG和几丁二糖有一定的活性,但对几丁质粉末和壳聚糖活性较低。RmChi44具有良好的抑菌性能,对植物病原真菌例如绿色木霉（Trichodermaviride）,刺盘孢菌（Col