园林生物技术

园林生物技术1564906041015169+1981043000081303都市规划与设计3171341422000090706园林植物与观赏园艺※1104939000560100风景园林硕士17+5563免费考研网园林植物与观赏园艺※12018474833免费考研网BiotechnologyofHorticulturalPlant园艺植物生物技术（理论课教案）华中农业大学园艺林学学院2007-2018-1

华中农业大学教案（首页）授课时刻2007年9-11月教案编写时刻2007年8月课程名称园艺植物生物技术课程编号总学时40讲课：30学时实验：10学时实习：学时学分数2.5课型必修课（）选修课（）理论课（）实验课（）任课教师郭文武、程运江职称教授、副教授（博士）授课对象2002（班）级园艺专业1、2班差不多教材或要紧参考书园艺植物生物技术，邓秀新、胡春根主编。高等教育出版社，2005H.S.Chawla植物生物技术导论(许亦农麻密译)化学工业出版社肖尊安植物生物技术化学工业出版社教学目的与要求通过本课程的学习，要求园艺专业学生把握园艺植物生物技术相关差不多理论和方法。教学重点、难点重点：生物技术的概念/应用现状、组织培养技术、病毒病脱除与无病毒繁育难点：原生质体操作技术、基因分离克隆、转基因技术教学进程第次课12-56-78-910-1112-1314-15授课章节（30学时）Theorypart1)Introduction2)Tissuecultureofhorticplant3)Protoplastculture&somaticfusion4)Viruseradication,detection&characterization5)Molecularmarkers6)Geneisolation&cloning7)Transgenictechniques学时2844444备注本课程采纳多媒体课件教学3次实验课，分不为实验室布局/大型生物技术仪器介绍、组织培养技术、DNA鉴定技术。华中农业大学教案（课时备课）第1次课2学时课目、课题（章节）要紧参考资料邓秀新胡春根主编园艺植物生物技术高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技术导论(许亦农麻密译)化学工业出版社肖尊安植物生物技术化学工业出版社教学目的和要求把握生物技术的概念、所包含的技术内容、对园艺科学进展的奉献及可能引起的深刻变化。了解园艺植物生物技术的进展历程课程要求与安排重点难点生物技术的内涵生物技术与产业的结合教学进程（含教学内容、教学方法、辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）课程安排生物技术的概念组织和细胞培养是园艺生物技术的平台基因工程技术是以后园艺生物技术的核心生物技术对园艺科学进展的奉献园艺植物生物技术的展望课程要求与安排一生物技术的概念以现代生物学理论为基础，以基因工程为核心的一系列技术的总称。狭义的植物生物技术：在离体条件下，对植物（细胞）进行遗传改良或使其增殖的各种技术的总称，包括细胞水平、分子水平两个大的层面。细胞学以及分子生物学是生物技术的基础。“Biotechnology”meansanytechnologicalapplicationthatusesbiologicalsystems,livingorganisms,orderivativesthereof,tomake,ormodifyproductsorprocessesforspecificuse.二生物技术进展的历史和作用（一）组织和细胞培养是园艺植物生物技术的平台1838-1839年，Schleiden和Schuwann提出植物和动物均由细胞构成，细胞进行分裂而增多，并组建成生物体的“细胞学讲”；同时指出，若提供的条件同在活体内一样，每个细胞应该能独立生存和进展。1943年，White出版了《植物组织培养手册》。1958年，Steward从烟草髓细胞培养出完整植株，向证明细胞全能性迈进了一大步。该结果促进了多细胞组织和器官的培养研究与应用。1960年Morel培养兰花茎尖获得再生植株，并证明脱除了病毒。该结果催生了兰花工业的进展。直到今天，世界兰花种苗差不多上通过组织培养生产。同年，Cocking通过酶解法从植物组织中分离得到去除了细胞壁的原生质体，使组织培养技术又向前迈进了一步。1962年，Murashige和Skoog发表了促进烟草快速生长的培养基配方，即今天十分流行的MS培养基。1964年，Guha和Maheshwari成功地从蔓陀萝花药培养得到再生植株，开创了花药培养获得单倍体的先河。1971年，Takebe等报道了烟草原生质体培养成为完整植株，至此，植物细胞全能性得到完全证明。次年，Carlson获得烟草两个种间的原生质体融合再生的体细胞杂种植株。植株组织培养的进展得益于两个方面的进展。一是对植物激素(planthormone)的认识，以及人工合成激素（生长调剂剂，plantgrowthregulator，PGR）的生产和应用，促进了植物组织培养技术的进展。1934年Went发觉了植物生长素；1956年Miller发觉细胞兴奋素。正是这些发觉带动了植物组织培养技术的进展。今天，组织培养研究多数情形下是在摸索激素配比，也讲明了植物激素研究对组织培养的重要性。第二是植物营养学科的进展。人们认识了植物生长必须的营养物质，利用该学科的成就，不断改进培养基配方，使得组织培养技术得到迅速普及。植物组织培养技术的进展和成熟，有了一个离体无菌的技术平台，人们才有可能进行今天的转基因研究，才会有“作物分子设计”的概念产生，才会有今天依靠离体培养的诸多技术的产生，如快繁技术，离体储存、茎尖微芽嫁接脱除病毒技术等。能够讲，组织培养技术是植物生物技术的差不多平台，一个作物组织培养技术的成熟程度能够阻碍其基因工程的进展。（二）基因工程技术是以后园艺植物生物技术的核心基因工程技术的进展以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志。人们把1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，作为分子生物学和基因工程技术的里程碑。与组织培养技术的进展历程类似，基因工程技术的进展得益于生物化学、遗传学、细胞学等多个学科的进展。1983年，世界上首批转基因烟草和马铃薯咨询世；1986年，首批转基因植物进入田间实验；1993年，转基因番茄在美国面市。尽管转基因番茄没有在美国得到大面积推广应用，但转抗除草剂的大豆、转抗虫基因的玉米在美国等国家大面积推广，产品已销往世界许多国家。（三）生物技术对园艺科学进展的奉献1.脱毒与快繁技术广泛用于园艺作物种（苗）的生产2.花药培养以及小孢子培养是获得单倍体以及纯合二倍体材料的最佳途径3.胚抢救技术克服了果树早熟品种选育的技术难题4.细胞融合技术制造出200多例柑橘体细胞杂种5.分子标记广泛应用于育种和资源研究6.基因克隆与遗传转化方兴未艾（四）园艺植物生物技术的展望三、课程要求与安排总学时40，其中理论课30学时，实验课10学时授课教师郭文武：博士/教授程运江：博士/副教授要求：认真听讲，做好实验，把握差不多原理和技术成绩：平常20%，实验或期中20%，期末考试60%作业布置；生物技术包括哪些内容？生物技术进展经历了哪几个时期？生物技术对园艺生产可能带来哪些革命性的进步？生物技术进展过程中要注意哪些可能产生负面阻碍的咨询题？课后自我总结分析绪论应讲得宏观一些，激发同学们对该课程的学习爱好，同时幸免与后面各章节内容的重复。注：板书设计可在授课进程中直截了当用横线、浪线等标示出。

华中农业大学教案（课时备课）第2-5次课8学时课目、课题（章节）第二章植物组织与细胞培养技术要紧参考资料邓秀新胡春根主编园艺植物生物技术高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技术导论(许亦农麻密译)化学工业出版社肖尊安植物生物技术化学工业出版社教学目的和要求把握植物组织培养的原理与技术了解植物组织培养技术在园艺生产与品种改良中的应用现状与前景重点难点组织培养技术组织培养技术的应用教学进程（含教学内容、教学方法、辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）组织培养(Tissueculture)指通过无菌操作分离植物体的一部分，即外植体（explants）接种到人工培养基（medium)，在人工操纵的条件下（包括营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其产生完整植株的过程。一植物组织培养类型（一）依照培养方式：（二）依照培养过程分：（三）、依照培养材料分二、组织培养的意义园艺植物组织培养的意义和应用加速无性或有性世代的繁育，缩短育种周期或获得新的基因。克服远缘杂交不亲和的障碍，促进幼胚发育。获得三倍体。快速繁育苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。获得无病毒苗木。离体储存（包括超低温）种质资源三、组织培养理论与技术进展简史1.探究时期1902年，植物生理学家（德），依照细胞理论，提出：高等植物的器官和组织能够不断分割、直至单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）的理论。即植物的体细胞在适当条件下，具有不断分裂和繁育，进展成完全植株的潜在能力。HABERLANDT2.奠基时期3.迅速进展时期四技术的进展（一）材料范畴的逐步扩大第二节组织培养原理与技术细胞是生物有机体的差不多结构单位，专门是植物细胞又是在生理上发育上具有潜在全能性的单位。受精卵：能够产生具有完整形状和结构和功能的植株。体细胞：也具备遗传信息的传递、转录和翻译的能力。Basisforcellculture细胞分化和形状建成1．合子胚的发育，经历生长和分化过程，生长为完整结构的有机体；2．体细胞生长（类似），开始是进行生长。从一个分化的有专一功能的细胞，要表现它的全能性，第一要通过去分化（脱分化）的过程，改变细胞原先的结构、功能，而回复到无结构的分生组织状态，即愈伤组织状态。愈伤组织分生细胞团再分化，进行形状建成，而产生完整植株。（体细胞胚胎发生）最常见的再分化是根的形成：3种方式（1）先形成根的，往往抑制芽的形成；（2）先形成芽的，较易产生根；（3）同时产生芽和根。一样而言，芽和茎叶原基起源于组织培养中比较表层的细胞（外起源）根原基则发生在组织较深处（内起源）在组织培养中再生植株还可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，而成为完整的植株。有分化胚状体能力的种子植物已有117种（分属于34科，75属）。胚状体可从以下几种培养物中产生：1．直截了当从器官上发生；2．从愈伤组织上发生；3．从游离的单细胞发生；4．从小孢子发生。诱导胚状体与诱导芽相比，有3个显著优点：1数量多、速度快、结构完整；2胚状体以单细胞直截了当分化成小植株，比通过愈伤组织再分化要快；3胚状体一旦形成即可再生小植株，成苗率高。第二节实验室设计及差不多设备一实验室设置（一）基本实验室预备室预备室的功能确实是进行一切与实验有关的预备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时刻保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室培养室的功能是对离体材料进行操纵培养。其首要要求是要能操纵光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。（二）辅助实验室细胞学实验室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情形下可建立此实验室。生化分析室在以培养细胞产物为要紧目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。二培养容器与用具玻璃容器塑料容器金属用具塑料用具第三节组织培养基一培养基的种类和成分（一）培养基的种类1．培养基是组织培养最重要的基质。2．培养基的名称－－多数以发表人的名字命名，再加上年号。3．国际上常用的五种培养基：MS：Murashige和Skoog(1962)ER：Eriksson（1965）B5：Gamborg等（1968）SH：Shenk和Hildebrandt（1972）HE：Heller（1953）MS（Murashige和Skoog1962）M6（朱至清1975）：用于禾本科植物花药组织培养Miller（1963）：一样组织培养H（Bowgin和Nitsch）：一样组织培养T（一样组织培养）White（1963）：一样组织培养B5（Gamborgetal1968）一样组织培养C17（王培等1986）：小麦花药培养W14（欧阳俊闻等1988）：小麦花药培养KM8P（Kaoetal1975）：原生质体培养LloydandMccoun（Lloyd1980）：木本植物培养RM（Reinentetal1967）：兰花4．各培养基特点MS：用于烟草细胞，硝酸盐、钾和铵的含量比其它培养基高。ER：与MS相似，磷酸盐的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。B5：为培养大豆的细胞组织设计，铵的含量低。SH：与B5相似，无机盐的含量稍高。HE：无机盐浓度稍低，水稻愈伤组织培养上使用。(二)培养基成分要紧为五大类：（一）水（二）无机盐大量元素微量元素（三）有机化合物1．碳水化合物2．植物激素3.维生素：维生素C、B1、B6、烟酸、叶酸、一样0.1～0.5mg/L。4．肌醇：一样用量100mg/L5．氨基酸（四）天然复合物1．椰乳coconutmilk2．香蕉3．胳朊加水分解物（1）要紧成分为氨基酸，浓度100～200mg/L。（2）受酶和酸的作用易分解。4．马铃薯（1）去皮和芽，煮30分钟，过滤，一样150～200mg/L。（2）对pH缓冲作用大。5．其它（1）酵母提取液、麦芽提取物、苹果汁、番茄汁、黄瓜果实、未熟玉米的胚乳。（2）遇热较稳固，大多在培养困难时使用，有时有效。（五）培养材料的支持物1．琼脂（agar)（1）凝固剂，一样0.6～1%.（2）为防止有害物质毒害，可加1～10g/L的活性炭。2．其它：玻璃纤维、滤纸桥等。（六）抗生物质防止内生菌，可加抗生物质。二培养基的制备（一）母液配制和储存（二）配制过程（三）pH值的调剂（四）培养基分注：趁热分注（五）灭菌和洗涤三生长调剂物质的应用（一）生长素1．吲哚乙酸（IAA）：有天然，也可合成，活力低。遇高温高压、遇酶、受光易分解，对器官形成副作用小。2．萘乙酸（NAA）：可人工大量生产，高温高压下稳固，功能比IAA高3.7倍。3．2,4-D：可促进愈伤组织形成。不同器官对生长素的反应根：对生长素最敏锐，低浓度下10－5～10－3PPM，可促进生长；浓度高时，抑制生长。芽：浓度略高时，促进芽的生长。愈伤组织：高浓度的生长素可诱导产生，而且对愈伤组织的再分化也有诱导作用。其它：可促进细胞伸长、分裂、分化；还可促进新成代谢。（二）赤霉素（GA3）1．GA3对整个植株的作用比离体器官或组织作用显著，这与生长素不同。2．GA3有刺激器官生长的作用，但抑制器官的发生。3．GA3可刺激植物体内生长素的生物合成。（三）细胞分裂素1.对细胞分裂与分化，以及细胞的增大有促进。2.可解除顶端优势，促进侧芽生长。3.可减少叶绿素分解、延缓叶片衰老。4.对根的生长起拟制作用。生长调剂物质的使用溶剂1．水中直截了当溶解困难。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等则可用0.1～1N的HCl溶解，再加水。2．也可配制母液，低温贮存使用，用量极微，一样用mg/L表示。使用量1．一样生长为0.05～10mg/l。细胞分裂素0.05～20mg/l。2．生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。生长素/细胞分裂素低促进芽形成生长素/细胞分裂素高促进根形成一StepsofMicropropagationStage0–Selection&preparationofthemotherplantsterilizationoftheplanttissuetakesplaceStageI

-InitiationofcultureexplantplacedintogrowthmediaStageII-Multiplicationexplanttransferredtoshootmedia;shootscanbeconstantlydividedStageIII-RootingexplanttransferredtorootmediaStageIV-Transfertosoilexplantreturnedtosoil;hardenedoff二外植体灭菌过程材料与前处理灭菌强度药剂种类与消毒处理时刻三、组织培养过程中的变异现象（一）现象SomaclonalVariation:variabilityinplantsregeneratedfromtissueculturethatiseitherinducedoruncoveredbyatissuecultureprocess.Mostsomaclonalvariationisnegative,butifenoughplantsareexamined,positivechangescanusuallyberecovered.Thesourceformostbreedingmaterialbeginswithmutations,whetherthemutationoccursinamoderncultivar,alandrace,aplantaccession,awildrelatedspecies,orinanunrelatedorganismTotalsourcesofvariation:Mutation,Hybridization,PolyploidySomaclonalvariationisageneralphenomenonofallplantregenerationsystemsthatinvolveacallusphaseTherearetwogeneraltypesofSomaclonalVariation:Heritable,geneticchanges(altertheDNA)Stable,butnon-heritablechanges(altergeneexpression,AKAepigenetic)Sinceutilizingsomaclonalvariationisaformofmutationbreeding,weneedtoconsidermutationbreedinginmoredetail→InducingMutationsPhysicalMutagens(irradiation)Neutrons,AlpharaysDenselyionizing(“Cannonballs”),mostlychromosomeaberrationsGamma,Beta,X-raysSparselyionizing(“Bullets”),chromosomeaberrations&pointmutationsUVradiationNon-ionizing,causepointmutations(ifany),lowpenetratingChemicalMutagens(carcinogens)ManydifferentchemicalsMostarehighlytoxic,usuallyresultinpointmutations（二）组织培养过程变异的利弊与利用AdvantagesScreenveryhighpopulations(cellbased)CanapplyselectiontosinglecellsDisadvantagesManymutationsarenon-heritableRequiresdominantmutation(ordoublerecessivemutation);mostmutationsarerecessiveCanavoidthisconstraintbynotapplyingselectionpressureinculture,butyouloosetheadvantageofhighthrough-putscreening–havetogrowoutallregeneratedplants,produceseed,andevaluatetheM2Alternative:performonhaploidcelllinesDiseaseResistantSuccessusingSomaclonalVariation第五节几种组织培养技术在园艺中应用一胚培养（EmbryoCulture）EmbryoCultureasaSourceofGeneticVariationRescueF1hybridfromawidecrossOvercomeseeddormancy,usuallywithadditionofhormonetomedia(GA)ToovercomeimmaturityinseedTospeedgenerationsinabreedingprogramTorescueacrossorself(valuablegenotype)fromdeadordyingplantHybridizationCantransfermutantallelesbetweenspeciesCanintroducenewgeneticcombinationsthroughinterspecificcrossesPolyploidyCancombineembryoculturewithchromosomedoublingtocreatenewpolyploidspecies(allopolyploidy)Embryoculturedevelopedfromtheneedtorescueembryos(embryorescue)fromwidecrosseswherefertilizationoccurred,butembryodevelopmentdidnotoccur;Thesetechniqueshavebeenfurtherdevelopedfortheproductionofplantsfromembryosdevelopedbynon-sexualmethods(haploidproductiondiscussedlater)（二）胚抢救（EmbryoRescueProcess）MakecrossbetweentwospeciesDissectembryo(usuallyimmature)Theyoungertheembryo,themoredifficulttocultureGrowonculturemediumusingbasictissueculturetechniques,useforbreedingiffertileManytimes,resultingplantswillbehaploidbecauseoflackofpairingbetweenthechromosomesofthedifferentspeciesThiscanbeovercomebydoublingthechromosomes,creatingallotetraploidsPolyploidsareanothersourceofgeneticvariation→（三）幼胚离体培养的生长发育方式1.胚性发育(embryonaldevelopment)：2.早熟萌发(earlymaturesprouting)（四）胚抢救应注意的几个因素1培养时期自养（autotrophy）异养（heterotrophy）活体内胚>带胎座的胚珠>胚珠>退化或败育胚2.培养基和培养条件3.碳水化合物4.激素种类和水平5.温度两步培养法二胚乳培养（Endospermculture）概况：胚乳培养始于1933年，进行玉米胚乳培养。胚乳培养研究要紧集中探讨以下咨询题：1、胚乳细胞全能性：在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。2、多数被子植物胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养，探究改良农林、园艺植物三倍体育种技术的可能性。3、研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。迄今已有40多种植物进行胚乳培养。苹果、柚、甜橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等胚乳培养再生了植株。三花药和花粉培养图示流程Anther/MicrosporeCultureFactorsGenotypeAswithalltissueculturetechniquesGrowthofmotherplantUsuallyrequiresoptimumgrowingconditionsCorrectstageofpollendevelopmentNeedtobeabletoswitchpollendevelopmentfromgametogenesistoembryogenesis大多数园艺作物花粉培养适宜的时期为盛花期、处于单核中期至晚期的花粉（单核靠边期）PretreatmentofanthersColdorheathavebothbeeneffectiveCulturemediaAdditives,Agarvs.‘Floating’（三）花粉培养方法有二种方法，一种是将接种的花药在培养基上预培养数天，然后将花粉分离出来进行悬浮培养，小孢子便能够启动发育；另一种取出经消毒处理的花蕾中的花药，放在加有4～5ml的液体培养基的小烧杯中。用玻棒或镊子挤压花药，使花粉从花药中开释出来。再依照不同植物花粉粒的大小，选用孔径大小合适的尼龙网（孔径20～60μm）过滤，除去药壁组织。过滤后的花粉液再经低速离心（100～160r/min）3min，将沉淀用新奇培养期稀释，重复两次，可得到较纯洁的花粉群体。然后将花粉进行悬滴培养和液体浅层培养。（四）花粉培养的培养基差不多培养基MS、Nitsch、White和N6、NLN、B5等，其中花粉培养以MS、Nitsch或White最为常用碳源以蔗糖成效较好，一样花药培养蔗糖浓度为6%～10%，花粉培养则要求13%左右，不同植物种类品种所需蔗糖浓度有些差异。生长素和细胞分裂素比较常用，一样低浓度的生长素类物质可提高胚状体的诱导率而高浓度则易使胚状体发生愈伤组织化和使单细胞倍性复杂化。作业布置；概念：组织培养、体细胞无性系变异、外植体、愈伤组织、胚状体、细胞全能性、离体储存等简答题：简述组织培养室的差不多设施；简述培养基配制的差不多流程、应注意哪些方面？简述组织培养技术要紧有哪些应用？课后自我总结分析该章是本课程的重点，是同学们毕业后能够应用的最基础技术；除技术外，同学们对差不多建立起一个组培实验室也专门有爱好。注：板书设计可在授课进程中直截了当用横线、浪线等标示出。

华中农业大学教案（课时备课）第6-7次课4学时课目、课题（章节）第三章原生质体培养与体细胞融合要紧参考资料邓秀新胡春根主编园艺植物生物技术高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技术导论(许亦农麻密译)化学工业出版社肖尊安植物生物技术化学工业出版社教学目的和要求通过本次学习，要求同学们把握原生质体操作的意义、差不多步骤及应用，体细胞杂交的概念、融合方法方式、在育种中的应用。重点难点原生质体分离培养步骤、要紧应用；原生质体培养方法。原生质体融合方法/方式、要紧应用；体细胞杂种的遗传鉴定。教学进程（含教学内容、教学方法、辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）一、原生质体研究概况（一）原生质体的概念Protoplast(原生质体):anakedcellwithoutcellwallSub-protoplast(亚原生质体):incompleteprotoplastwithorwithoutnucleusNucleo-plast(核质体):nuclearprotoplastwithlittlecytoplasm(由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体，即小原生质体)(Miniprotoplast)Micro-protoplast:protoplastwithoneorafewchromosomesCytoplast(胞质体):enucleatedprotoplast(不含细胞核而仅含部分胞质的原生质体)(二)原生质体研究进展KeyachievementsinplantPPresearch1880,protoplastwasfirstusedbyHanstein1960,PPisolationfromtomatorootbyenzymeincubationbyCocking1971,mesophyllPPplantregenerationintobaccobyTakebe1981,embryogenicPPplantregenrationbyVardiinIsreal1985,FirstRicePPplantregenerationbyFujimura1986,singlePPculture&plantregenerationinRapeseedbySpangenbergFactsheetinplantPPresearchInHorticulturalcrops,citrusranksfirstinPPresearch.PPplantregenerationsucceededincitrus,persimmon,banana,apple,pear,grape,kiwi,etc.PPregenerationsucceededinover320plantspeciesbelongingto49families&146genera.Tendency:modelplantstostaple&economicplants;annualtoperennialplants.PPplantregenerationispossiblefromalmostallkindsofhigherplants.二、原生质体分离（一）原生质体分离的材料预备无菌试管苗叶片上胚轴和子叶

培养细胞（二）预处理及酶解酶溶剂及其渗透压溶剂：原生质体培养基或专门配制。渗透压调剂剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。材料预处理在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可提高原生质体的活力和分裂频率。用黑暗处理、低温处理和不同光质照耀等方法，可提高原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。例如，龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂，柑橘离体叶片在上午、温室叶片在遮荫、适宜温度（26-30C）条件下分离成效较好。酶处理原生质体收集和纯化过滤400-200目(40-100μ）界面离心法：13%甘露醇/25%蔗糖飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调剂剂，先将酶液洗洁净，再用Percoll飘浮一次。(三)原生质体活力测定目测法：在显微镜下观看，依照细胞形状、流淌性确定原生质体活力。

FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可在荧光显微镜下通过具荧光细胞的观看确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严峻损坏使，细胞才能被染色，因而能够通过细胞被染色与否确定活性。（四）阻碍原生质体活力的因素分离材料的生理状态酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时刻、酶溶液的渗透压分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离连续时刻环境条件：操作环境的温度、分离用具的阻碍三、原生质体培养（一）原生质体培养基1．无机盐大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；对某些植物原生质体分裂有抑制作用。有些仅用有机氮，如在菊苣原生质体培养中，将培养基中的氨和硝酸盐全部去掉，只以谷氨酰胺作为氮源，培养成效专门好(Grep，1982)。Ca2+浓度较高的ca”浓度能提高原生质体的稳固性，有利于原生质体生长和发育2．有机成分

维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。3.激素

常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D4.渗透压

常用的渗透压调剂剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。（二）原生质体培养方法液体浅层培养:Liquidthinlayerculture固体平板培养:Solidculture液体－固体双层培养:Liquidsolidculture琼脂糖珠培养:Agarosebeadculture（三）原生质体发育与植株再生1.细胞壁再生原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。新合成的细胞壁能够用0.1％荧光增白剂（Calcofluor）染色后在荧光显微镜下观看，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细胞壁差不多形成。也可用高渗溶液产生质壁分离的方法、电子显微镜观看技术和冰冻蚀刻法等进行再生细胞壁的研究。电镜观看发觉，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁要紧成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐步形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂的时期。2.细胞分裂和生长原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，RNA、蛋白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及胞质分裂。原生质体一样培养2～7d后开始第1次分裂，但开始第1次分裂的时刻随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。3.愈伤组织形成大多数情形下原生质体培养二周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1mm的小愈伤组织。原生质体培养7～10天后必需及时添加新奇培养基，否则形成的细胞团不连续生长。待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。（四）阻碍原生质体培养的要紧因素

基因型原生质体来源

起始培养密度与培养基差不多起始密度适宜密度为1-5×105/ml左右培养基激素水平（柑橘不要激素能够再生）密度与培养基营养成分完全性五、原生质体再生植株遗传及变异（一）染色体变异染色体倍性变异是原生质体再生植株的常见变异类型原生质体再生植株的倍性与分离原生质体的起始材料有关。由茎尖、叶肉和胚性组织的细胞分离的原生质体能较好地保持原先的倍性；用悬浮培养细胞专门是长期继代培养的细胞系分离的原生质体，较易显现染色体倍性及数目的变化。Grosser等（1984）报道由三叶草叶肉原生质体再生的植株为二倍体（2n=16），而由培养细胞分离的原生质体再生的植株为四倍体（2n=32）。原生质体再生植株变异还与植物种类有关(二)植株表型变异原生质体再生植株表型变异包括植物学性状、同功酶谱、抗性变异变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的变异有关。原生质体再生植株的变异可为体细胞遗传学研究和作物改良提供有用的材料。第二节体细胞杂交一、体细胞杂交的概念概念：体细胞杂交，即原生质体融合，将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）。SH,i.e.protoplastfusion,aprocessofPPsfromtwodifferentparentswereinducedtofuseandthenregenerateintoplantlets,alsonamedasSH(A+B)几种不同的表述：体细胞杂交：Somatichybridization细胞融合：Cellfusion原生质体融合：Protoplastfusion无性杂交：asexualhybridization超性杂交：Parasexualhybridization超性融合：Parasexualfusion细胞操作：Cellmanipulation细胞工程（Cellengineering）相关的术语（Terminology）对称杂种(symmetrichybrid)（双亲给杂种奉献的遗传物质均为100%）非对称杂种(asymmetrichybrid)（双亲给杂种奉献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（cytoplasmichybrid,Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组对称融合（symmetricfusion），也称标准融合（Standardfusion）非对称融合（asymmetricfusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分供-受体融合：Donor-recipientfusion体配融合（gameto-somaticfusion）（性细胞与体细胞融合）亚原生质体-原生质体融合：Subprotoplast-protoplastfusion小原生质体：Miniprotoplast微原生质体：Microprotoplast胞质体：Cytoplast胞质体-原生质体融合:Cytoplast-protoplastfusionTechnicaldevelopmentalhistory1)1970s,establishandoptimizeofPPtechnique2)1972,tobaccointerspecificsomatichybrid3)1975,highCa-highpHPEGfusion;electro-fusionNumerousreports,somewerenotrealistic4)Early1980s,modelplantstostaple/economiccrops,symmetrictoasymmetric,morerealistic5)Late1980s,manyreportsonperennialwoodyplants6)1990stodate,aconventional&safe‘biotech’forplantbreedingincitrus,rapeseed,wheatetc.二、原生质体融合（一）融合方法1.PEG-mediatedfusion

Characteristics:1)Meritsinclude:lowinput,highfrequencyofhetero-karyons,nospecieslimit;2)Defectsinclude:tediousfusionprocedure,toxicitytocells.

Workingmechanism:PEG分子具有轻微的负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，从而使原生质体发生粘连进而促进原生质体融合；PEG能增加类脂膜的流淌性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。融合液：CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH5.6诱导液：融合液＋PEG20～45％稀释液：A液（g/100ml）pH6.0B液(g/100ml)pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.1692．电融合法

Electro-fusion,ElectricallyinducedfusionThreeadvantagescomparedwithPEGfusionNotoxicitytoprotoplastsHigherfusionfrequencySimplermanipulationElectro-fusion:AhighfrequencyACfieldisappliedbetween2electrodesimmersedinthesuspensionofprotoplasts-thisinduceschargesontheprotoplastsandcausesthemtoarrangethemselvesinlinesbetweentheelectrodestoformpearl-chain.Theyarethensubjecttoahighvoltagedischargewhichcausestheirmembranestofusewheretheyareincontact.FusionparametersAlternatecurrentvoltage(交流电压)TimedurationofAC(交变电场处理时刻)Directcurrentvoltage(直流高频电压)Pulsewidth(脉冲宽度)No.ofPulses(脉冲次数)FactorsaffectingPPfusionPPquality(intact,viabilityetc)Fusionmethod(PEGorelectro-)Fusionparameters(电融合参数、溶液浓度等)

SHIdentificationMorphology:leafshape,thickness,stomadensity&numberCytology：Chromosomenumbers,flowcytometry,FISH/GISHIsozymeMolecularmarkers:RAPD,RFLP,RAPD,SSRetc.体细胞杂交技术的应用Tocircumventbiologicalbarrierstocreatenovelgermplasm(克服生殖障碍，制造新种质)Totransferbeneficialtraitstoimprovecropquality(转移有益性状，改良作物品质)Totransferpartialchromosomestoproduceasymmetrichybrids(转移部分染色体，制造非对称杂种)Totransfercytoplasmicgenometocreatecybrids(转移胞质基因组，制造胞质杂种)Toserveasbridgematerialforfurtherimprovement&breeding作业布置；原生质体培养有何意义？原生质体培养阻碍因素有哪些？体细胞融合与自然生殖过程的融合有何异同？如何增强体细胞融合过程双亲遗传物质的选择性分配？课后自我总结分析：内容较多，应侧重原生质体培养、融合原理与方法以及体细胞杂种的要紧应用，辅以典型实例，幸免过多介绍柑橘体细胞杂交。注：板书设计可在授课进程中直截了当用横线、浪线等标示出。

华中农业大学教案（课时备课）第8-9次课4学时课目、课题（章节）要紧参考资料邓秀新胡春根主编园艺植物生物技术高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技术导论(许亦农麻密译)化学工业出版社肖尊安植物生物技术化学工业出版社教学目的和要求了解园艺生产中存在的病毒病类型与检测方法了解病毒脱除的原理与技术方法重点难点病毒病脱除技术；病毒病的类型与分子检测方法教学进程（含教学内容、教学方法、辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）一病毒的定义病毒的定义：是一类没有细胞核、细胞质和细胞壁结构，但有遗传复制等生命特点，要紧由核酸和蛋白质组成的大分子生物。病毒个体相当微小，大多数病毒在100～300毫微米之间。病毒是结构简单的微小生命体，病毒粒体有各种不同形状，由一种核酸（RNA或DNA）”和不处的蛋白质（或脂蛋白质）衣壳所组成，同时在适宜的条件下至少能够在一种寄主上引起病害。病毒是传染性寄生物，它的核酸基因组的重量小于3×108道尔顿，需要有寄主细胞中的核糖体和其它成分才能增殖。二园艺植物病毒病的发生及危害特点（一）园艺植物病毒病的侵染特性与真菌和细菌病害不同，病毒多为系统性侵染（systemicinfection），即病毒侵染后专门快扩展至植物的全身，因此，从带有病毒的植株上取接穗或插条繁育的苗木，也带有病毒。埋伏侵染（latentinfection），这类病毒称为潜隐病毒（latentvirus）。（二）园艺植物病毒病的发生及危害特点四重要的园艺植物病毒及类似病原可引起植物的系统性发病表现特有症状外，有的其它病原引起的病害，也表现相似的发病特点，通常将病毒及这类病原引起病害统称为病毒类病害。病毒（virus）类病毒（viroid）植原体（phytoplasma）螺原体（spiroplasma）韧皮部及木质部限制性细菌等。这类病原引起的病害发病规律相似，均可通过嫁接传染，许多还可经由介体昆虫传播，在防治策略上也有相同之处。五园艺植物病毒病的防治（一）防治策略(1)栽培无病毒苗木(2)加强检疫(3)防治传毒虫媒(4)抗病毒基因工程（二）抗病毒基因工程将外源基因导入植物，使植物获得抗病性。一个重要的策略确实是利用来源于病毒本身的基因，这种通过将病原物基因导入植物而获得的抗病性称为病原获得抗病性（Pathogenacquiredresistance，PAR）。外壳蛋白(coatprotein)基因介导的抗性病毒复制酶基因运动蛋白基因RNA介导的抗性策略卫星RNA,缺陷干扰RNA,反义RNA和RNAi第二节病毒鉴定及检测技术生物学鉴定血清学鉴定核酸分析一生物学鉴定植物病毒都有一定的寄主范畴，并在某些寄主植物上表现特定的症状，这种能鉴不某种病毒的植物通常称为指示植物或鉴不寄主。有些鉴不寄主对病毒的侵染易产生枯斑，因此将产生枯斑的寄主也称为枯斑寄主。鉴不寄主能够是草本和木本植物。常用的接种方法包括汁液摩擦接种和嫁接传染。（一）草本指示植物鉴定植物种类，常用的有藜科、茄科、豆科、葫芦科等植物。接种方法汁液摩擦法，从待检植株上取一定的组织，包括叶片、花瓣、根、或枝皮，加入2~5倍（V/W）的提取缓冲液，在低温条件下研磨，然后蘸取汁液在撒有金刚砂的供试指示植物叶片上轻轻摩擦，接种完毕赶忙用蒸馏水冲洗净叶片上残留的汁液。然后将指示植物放在22~28℃、半遮荫的条件下生长，定期观看并记录指示植物的症状反应。（二）木本指示植物鉴定常用木本指示植物接种方法1.汁液磨擦接种2.嫁接接种（1）双重芽接法（2）双重切接法（3）指示植物直截了当嫁接法3.昆虫传毒鉴定法二血清学检测抗原（antigen）：凡注射到动物体内能刺兴奋物机体产生免疫反应的物质均可称为抗原。抗原刺兴奋物机体发生免疫反应而产生抗体的特性叫免疫原性；抗原能与所产生的抗体发生特异性结合，这种特性叫反应原性；抗原性上述二者合称。兼具这两种特性的抗原物质称为完全抗原；只有反应原性，没有免疫原性的抗原物质称为半抗原。（一）植物病毒抗血清制备(1)病毒抗原的分离纯化与制备从感染病毒的寄主植物中，通过物理和化学的方法，将病毒与寄主植物的各种组分分离，以获得纯洁的病毒制品。病毒抗原的制备方法，要紧步骤包括分步沉淀、差速离心和梯度离心等,去杂质浓缩病毒。（二）植物病毒抗体制备（1）植物病毒抗血清制备用纯化的病毒抗原免疫注射动物获得。常用动物为家兔，一样选用半周岁左右、体重2－3千克、健康、自然抗体阴性的日本大耳兔和半耳垂家兔.以上方法制备的抗血清含有多种抗体，这些抗体是由动物的多种淋巴细胞所产生的，因此也称为多克隆抗体（Polyclonalantibody，Pab）(2)单克隆抗体单克隆（Monoclone）即是单一的无性细胞系，或称单细胞系。单克隆抗体确实是由免疫动物的单细胞系所产生的抗体。（三）常用血清学检测方法（1)免疫电镜技术（Immunoelectronmicroscopy，IEM）是将抗原与抗体的专化性免疫反应与电镜观看相结合的一种病毒检测方法。其操作简便、结果判定直观。抗原吸附→免疫修饰→染色→透射电镜观看(2)酶联免疫吸附分析（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay，ELISA）酶联免疫吸附分析（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay，ELISA）具有检测灵敏度高、快速、简便、准确等优点，不需要提纯病毒，可在较短时刻内检测大量样品。直截了当法即所用酶标抗体为病毒特异抗体，因此针对不同抗体需分不进行标记；间接法所用酶标抗体为通用的市售抗体，如：羊抗兔酶标抗体、羊抗鼠酶标抗体等，因此无需对每一抗体进行标记双抗体夹心法（DoubleantibodysandwichELISA，DAS-ELISA）是一种直截了当法。第一用病毒特异性抗体（IgG）包被微板孔，然后加入待检样品粗提液，使包被的抗体捕捉样品中的病毒粒子，再加入酶标抗体，最后加入底物，室温避光放置一定时刻后，判定结果A蛋白酶联免疫吸附法（ProteinAsandwichELISA，PAS-ELISA）为一种间接法。第一用A蛋白包被微板的孔，然后加入病毒的抗体，再加入待检样品粗提液，经第二层抗体与病毒结合，加入酶标记A蛋白，最后加入底物，室温避光放置一定时刻后，判定结果。(3)直截了当组织免疫杂交分析（Directtissueblotimmunoassay，DTBIA）也称组织免疫印迹ELISA（TissueprintingELISA）分析，是ELISA的另一形式，其原理与ELISA相似，所不同的是用一种专门的薄膜代替常规的微量板作固相支持物，酶催化底物反应产生的是不可溶的有色物质沉积在带病毒的部位，观看有色物质即可判定是否带有病毒。通过组织切面在膜上产生印迹，将抗原直截了当束缚在膜上，不需要制备或提取样品，而且可直截了当提供病毒在组织中的分布信息，专门适合于韧皮部限制性病毒的检测，具有灵敏度高、结果可靠和快速的特点，该项技术已成功应用于柑橘速衰病毒（CTV）的检测（四）核酸分析电泳分析在类病毒的检测中应用广泛，类病毒为环状单链RNA分子，大小为246~375个核苷酸（nt），内部碱基高度互补。在自然情形下形成棒状或三叶草状的二级结构，在常规电泳条件下迁移较快；在变性条件下，由于二级结构破坏而成环状，在电泳介质中迁移减缓，而与其它小分子物质分开，表现类病毒的特有电泳条带。因此双向电泳也是鉴不一种病原是否为类病毒的常用技术。PCR技术病毒和类病毒的基因组成差不多明确，能够依照已知序列设计特异引物进行PCR检测核酸杂交技术探针第三节园艺植物病毒脱除技术一无病毒的培养方法热处理茎尖培养脱毒其它组织培养脱毒茎尖微芽嫁接脱毒热处理结合茎尖培养脱毒化学治疗脱毒二、热处理脱毒柑橘黄龙病50℃50min蒸气或37℃，3周柑橘衰退病40/30变温，7－12周柑橘碎叶病40/30变温，8周草莓斑驳病37－38℃，2周通常，热处理对球状、线状病毒、类菌质体、类细菌体是有效的。对类病毒没有成效。三茎尖脱毒1．White（1943年）第一发觉了感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点邻近病毒浓度专门低；2．Morel等（1953）从感染花叶病毒的大丽菊分离出了茎尖分和组织，并得到无病毒植株。3．以后，相继在其它植物培养成功，如：马铃薯、菊花、兰花、百合、草莓、矮牵牛、茑尾；四其它方法脱毒1．愈伤组织培养无病毒苗：取材方便，一次可得到大量无病毒苗；2．茎尖微体嫁接培养：桃、柑桔、苹果等，砧木试管培养，然后嫁接无病芽；3．珠心胚培养：柑桔类，通过珠心细胞产生无性胚（珠心胚），培养能够得到无病毒的珠心胚苗。4.花粉培养获得无病毒苗木五茎尖微芽嫁接脱毒培养无病毒植株解决生根难的咨询题茎尖嫁接苗无童期的，能快开花结果。从1980年开始，农业部在华中农业大学建立了柑橘研究所，在章文才教授的主持下，仿照西班牙无病毒良种生产程序，领先在我国进行柑橘茎尖微芽嫁接及无病毒良种繁育技术研究，该项目1986年获农业部科技进步二等奖。此后后，华中农业大学柑橘研究所为全国柑橘主产区培养了大批技术骨干。1988至1991我所与广西农垦局横向联合，培养了12个优良柑橘品种脱毒苗200余株，为广西省无病毒柑橘推广起到了良好的示范作用。茎尖嫁接脱毒的原理茎尖微芽嫁接脱毒：依照一样病毒在植物体内分布不平均，顶端生长点的分生组织不带毒或检查不到病毒的原理，通过茎尖嫁接脱毒得到无毒苗。目前茎尖嫁接方法可脱去柑桔大多数病害，这一方法被世界各国普遍采纳，成为获得柑桔良种无毒植株的要紧手段。操作方法：试管砧木苗的培养茎尖消毒和嫁接移栽试验病毒鉴定六几种常见园艺病毒病及脱除（一）柑橘黄龙病病症黄龙病又名黄梢病，国外称青果病，是国内外检疫对象。过去称之为类细菌[Bacteria-likeorganism(BLO)]，最近国外研究证实为一种细菌又称难培养细菌[Fastidiousbacteria(FB)]。该病远距离传播，通过带菌苗木和接穗的调运。从病区传播到新区。田间初侵染源来自病树，柑橘木虱是传病的介体昆虫。最感病的品种为蕉柑和芦柑，其次为甜橙和柚，温州蜜柑则较耐病。1传播媒介—木虱2症状①斑驳型黄化，叶片呈黄绿相咨询的不平均斑块状，这种类型最为常见，是田间诊断黄龙病的要紧依据。②平均黄化型，即呈平均的浅黄色。③缺素型黄化，显现在中、晚期病树上，叶脉及其邻近呈绿色，而叶肉呈黄色，类似缺锌、缺锰症。患病树叶小，质硬，无光泽，常早落。开花多而早，花瓣短小肥厚，多个花朵集合成团，落花落果严峻。果实小，畸形果脐歪斜，着色不均，有的品种果蒂周围变红色，而其余部分仍为青色，俗称“红鼻果”。3防治方法①实施检疫，严禁病区苗木向新区、无病区调运。②建立无病苗圃，培养推广无病苗木。③及时挖除病树并集中烧毁。④防治柑橘木虱，在每次抽梢期喷药1—2次，操纵传病虫媒，抑制病害蔓延。4.指示植物长春花苗接种黄龙病病原，叶片显现黄化斑驳。（二）柑橘衰退病又名速衰病，在我国分布普遍，要紧为害以酸橙为砧木的嫁接树。由于我国目前栽培的柑橘一样采纳耐病的砧木，故大多植株带病而不表现明显症状。1.症状橙作砧木的甜橙苗木，一样在嫁接当年于6—7月开始显症，新梢部分叶片主侧脉邻近绿色，叶肉黄化，似缺锌症。后主侧脉邻近也褪绿，呈平均黄化。黄化叶片中间常留近圆形小绿岛。苗木发病后第二年黄化不显著，但生长衰弱。嫁接口上部主干表现肿大、切下嫁接口交叉处的皮层，可看到病树内皮层上：显现“蜂窝”状陷点，木质部外表则显现刚毛状小突刺。大树发病常大部分大枝或个不大枝先表现。发病植株矮化，抽梢少或不抽梢、老叶失去光泽并显现不同程度的黄化。病树逐步落叶，自顶部向下枯梢，缓慢衰亡。有时病树显症后不久即突然凋萎枯死，故称之速衰病。指示植物墨西哥来檬、尤力克柠檬和葡萄柚上的症状为新长出的叶片显现“明脉”，茎干的木质部显现凹陷点或凹陷条沟。植株矮化，叶脉木质化，叶片黄化呈匙状。2.防治方法①选择耐病砧木，如枳、酸橙、枳橙和红桔等。②选用无病毒的繁育材料。③防治媒介昆虫蚜虫。④用弱毒株系预先接种，干扰强毒株系的侵染为害。3.病原和发病规律由柑橘衰退病毒(CitrusTristezaVlrus简称CTV)引起。远距离传播通过带病苗木和嫁接材料调运，田间要紧通过蚜虫传播。作业布置；什么叫病毒？园艺作物病毒病发生和传播有何特点？如何防治病毒病？园艺植物病毒鉴定有哪些方法？园艺作物病毒病如何脱除？课后自我总结分析内容较多，脱毒原理与要紧方法应重点讲解。注：板书设计可在授课进程中直截了当用横线、浪线等标示出。

华中农业大学教案（课时备课）第10-11次课4学时课目、课题（章节）第五章分子标记技术要紧参考资料邓秀新胡春根主编园艺植物生物技术高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技术导论(许亦农麻密译)化学工业出版社张献龙植物生物技术科学工业出版社，2005教学目的和要求要求同学们把握分子标记的差不多原理、要紧分子标记类型，以及在园艺植物研究中的应用。重点难点分子标记的要紧类型和应用；分子标记的差不多原理。教学进程（含教学内容、教学方法、辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）分子标记的原理DNA是要紧的遗传物质DNA的生物学特性DNA检测技术目前常用的分子标记技术RFLPRAPDSSRAFLP分子标记在园艺植物中的应用品种鉴不与产权爱护种质资源研究分子标记辅助育种构建遗传图谱、基因定位与克隆重要概念：1、遗传标记（Geneticmarkers)：是能明确反映遗传多态性的生物特点，它包括：形状标记、细胞学标记、生化标记和分子标记2、遗传多态性(Geneticpolymorphisms)：经典遗传学中指等位基因的变异；现代遗传学中指的是基因组中任何位点上的相对差异。3、分子标记：能明确反映遗传多态性的外观性状，一样用肉眼可识不，或物理仪器便可识不的性状。4、细胞学标记：能明确反映遗传多态性的细胞学特点，染色体结构的数目是常见的细胞学标记，它能反映染色体结构的数目的遗传多态性（染色体缺失、重复、倒位、易位）。5、生化标记：可分为酶蛋白质和非酶蛋白质两类。在非酶蛋白质中用得最多的是种子贮藏蛋白；同工酶（isoenzyes）：催化功能相同，但结构的生理性质不同的一类酶。6、DNA标记：一切能揭示DNA多态性的技术手段；它是DNA水平上遗传多态性的直截了当反映，可分为：基于DNA-DNA杂交的标记；基于PCR的DNA标记；PCR与杂交相结合的标记；SNP。7、RFLP（限制性片段长度多态性）：RestrictionFragmentLengthPolymorphism，物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱8、PCR（聚合酶链式反应）：PolymerphaseChainReaction，是在试管中模拟细胞内的DNA复制。9、RAPD(随机扩增的多态性DNA）：RandomamplificationofPolymorphicDNA，以PCR为基础,利用人工合成的约10b的随机序列寡核苷酸作引物,以生物的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,产生不连续的DNA产物,通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。RAPD反应的循环次数可多达40—50次,每次循环中,双链DNA在95℃的高温下变性,解开双螺旋成为单链模板,然后在低温(36℃)条件下与随机引物结合,在DNA多聚酶的作用下，按碱基互补原则沿5‘至3’的方向把核苷酸链延长，完成DNA复制。如此反复数十次,能够使单一的DNA序列扩增105-107倍。10、SSR（简单序列重复）:SimpleSequenceRepeat，又称微卫星DNA（microsatellite）或短的串联重复（ShortTandemRepeat,STR)；一类由几