PD-1通路在BVDV抑制牛外周血T淋巴细胞增殖、诱导凋亡中的作用及其机制

PD-1通路在BVDV抑制牛外周血T淋巴细胞增殖、诱导凋亡中的作用及其机制牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)是在世界范围内对养牛业造成巨大经济损失的重要传染病,也是规模化养牛场和国际贸易中重点检疫的牛传染病。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)急性感染可导致牛外周血淋巴细胞(PBL)减少、凋亡和免疫抑制。在慢性病毒感染过程中PD-1信号通路可以介导协同抑制信号,抑制T淋巴细胞的活化、增殖,诱导凋亡。然而,在急性病毒感染中PD-1通路对T细胞的调控作用并不明确。尤其是在BVDV急性感染中PD-1通路是否参与调控了PBL的减少和凋亡,促进免疫抑制的形成,尚不明确。为了确定PD-1通路是否与BVDV急性感染导致的牛PBL减少和凋亡具有相关性。首先,采用梯度密度水平离心法从BVDV急性感染牛颈静脉抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC),再通过免疫微珠法从PBMC中分选出PBL和CD14~+外周血单核细胞(PBM),qRT-PCR和Westernblot检测两种细胞亚群的PD-1和PD-L1表达水平,流式细胞术检测PBL凋亡,CCK-8法检测PBL增殖。其次,选择CP型BVDV-1NADL株和NCP型BVDV-1KD株分别体外感染健康牛PBMC,再分选出PBL和CD14~+PBM,检测PD-1和PD-L1表达水平,以及PBL增殖和凋亡情况。结果表明,与健康牛相比,BVDV急性感染牛PBL的PD-1mRNA(p<0.001)和蛋白表达水平(p<0.01)显著上调,CD14~+PBM的PD-L1mRNA(p<0.01)和蛋白表达(p<0.01)显著上调,同时PBL的凋亡显著增加(p<0.001),增殖显著减少。其次,CP和NCP型BVDV体外感染均可诱导PD-1和PD-L1mRNA和蛋白表达的显著上调,随着感染时间的延长PD-1和PD-L1mRNA的表达水平逐渐升高,PD-1和PD-L1的表达上调伴随着PBL凋亡显著增加(p<0.05)和增殖的显著减少。为了确定阻断PD-1通路对PBL凋亡和增殖的影响。选择CP型BVDV-1NADL株和NCP型BVDV-1KD株分别体外感染健康牛PBMC,采用单抗阻断PD-1通路,再通过流式细胞术检测PBL凋亡,CCK-8法检测PBL增殖,ELISA检测细胞因子分泌,以及qRT-PCR检测病毒载量。结果表明,阻断PD-1通路可以显著减少BVDV体外感染导致的PBL凋亡(p<0.05),恢复了PBL的增殖(CP型BVDV,p<0.05),降低了病毒载量(p<0.05),增加了IFN-γ(CP型BVDV,p<0.01)和IL-2(p<0.05)分泌水平。为了确定BVDV体外感染中阻断PD-1通路对PBL亚群凋亡和增殖的影响。选择CP型BVDV-1NADL株和NCP型BVDV-1KD株分别体外感染健康牛PBMC,通过免疫磁珠法分选CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和CD21~+B细胞等PBL亚群,检测PBL亚群PD-1蛋白表达情况。采用单抗体外阻断PD-1通路,检测PD-1阻断对高表达PD-1的PBL亚群凋亡和增殖的影响。结果表明,CP和NCP型BVDV体外感染均能显著提高CD4~+(CP型BVDV,p<0.01;NCP型BVDV,p<0.001)和CD8~+T细胞(CP型BVDV,p<0.001;NCP型BVDV,p<0.05)表面PD-1的表达,而CD21~+B细胞表面PD-1表达差异不显著。此外,PD-1阻断可以显著减少CP和NCP型BVDV感染导致的CD4~+和CD8~+T细胞凋亡。在CP型BVDV感染中PD-1阻断可以显著恢复CD4~+和CD8~+T细胞增殖。但在NCP型BVDV感染中PD-1阻断仅显著恢复了CD4~+T细胞增殖。为了确定BVDV体外感染中PD-1通路调控CD4~+和CD8~+T细胞凋亡和增殖的分子机制。采用单抗体外阻断PD-1通路,通过Westernblot检测PD-1通路下游调控凋亡和增殖的关键信号分子蛋白丰度和磷酸化水平。结果表明,在CP型BVDV体外感染中阻断PD-1通路可以显著上调CD4~+和CD8~+T细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-ERK表达,同时显著下调与凋亡有关的信号分子cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的表达。在NCP型感染中阻断PD-1通路可以显著上调CD4~+和CD8~+T细胞的p-PI3K和p-Akt的表达,下调cleaved-caspase9和cleaved-caspase3表达,此外,CD4~+T细胞p-mTOR的表达显著上调(p<0.01),但CD8~+T细胞中表达变化不显著,CD4~+和CD8~+T细胞中p-ERK的表达变化均不显著。综上所述,CP型BVDV可以通过PD-1介导的协同抑制信号,抑制下游PI3K/Akt/mTOR和ERK通路,激活caspase9/caspase3凋亡信号通路,进而抑制CD4~+和CD8~+T细胞增殖,诱导凋亡。NCP型BVDV通过PD-1通路抑制ERK通路,进而抑制CD4~+T细胞增殖,通过激活caspase9/caspase3通路,诱导CD4~+和CD8~+T细胞凋亡,但不能通过抑制PI3K/Akt/mTOR和ERK通路,来抑制CD8~+T细胞的增殖。我们推