3.2基因工程的基本操作程序（第2课时）

第三章基因工程第2节第2课时将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定（课前+课中+课后，三案一体）课前案【预习新知】一、将目的基因导入受体细胞1.转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.转化方法（1）导入植物细胞常用方法：花粉管通道法、农杆菌转化法（适用于双子叶植物或裸子植物）。（2）导入动物细胞①常用方法：显微注射技术。②常用受体细胞：受精卵。（3）导入微生物细胞①方法：用Ca+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。②受体细胞：原核生物（使用最广泛的是大肠杆菌）。③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。二、目的基因的检测与鉴定检测水平检测方法分子水平检测通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否转录出了mRNA.检测目的基因是否翻译出蛋白质，采用抗原—抗体杂交法.个体生物学水平鉴定如做抗虫或抗病接种实验等三、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。（2）在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。（3）电泳：在一定的pH下，DNA分子中具有的可解离基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子向着与它所带电荷相反的电极移动的过程。（4）PCR产物的鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳。2.目的要求（1）了解PCR的电泳鉴定的基本原理。（2）尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。3.方法步骤（1）用微量移液器按照PCR反应体系的配方或PCR试剂盒说明书，在微量离心管中依次加入各组分。（2）待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。（3）设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。（4）根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖融化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。（5）将温热的琼脂糖溶液迅速导入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。（6）待凝胶电泳溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。（7）将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。（8）将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。（9）接通电源，根据电泳槽阴极至阳极之间的距离来设定电压。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。（10）取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。【预习自测】科学家利用基因工程技术将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高。在培育转基因番茄的过程中，下列操作不合理的是（D）A.可用PCR技术获得抗冻蛋白基因B.将抗冻蛋白基因与相应载体连接构建基因表达载体C.利用农杆菌转化法将基因表达载体导入番茄体细胞D.在低温条件下筛选已导入抗冻蛋白基因的番茄细胞第2课时将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定课中案【导】旧知回顾：基因工程的基本操作程序（4个步骤）【思】1.基因工程的基本操作程序主要包括那几个步骤？2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？【议】1.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入分别时什么？①两次拼接第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上。第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的TDNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。②两次导入第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞2.将目的基因导入受体细胞时，动物和植物相同吗？不相同。植物是体细胞，动物一般是受精卵。3.将目的基因成功导入受体细胞后是否意味着基因工程操作成功？应如何检测？不一定，还需要进行检测。分子水平：①通过PCR等技术检测目的基因是否整合到受体细胞DNA或检测目的基因是否转录出mRNA②通过抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达个体水平：一般要进行抗病或抗虫接种实验。4.是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。5.进行电泳鉴定的结果，如果扩增不成功，可能的原因有什么？漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。6.如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有什么？引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。【展】学生展示讨论结果【评】将目的基因导入受体细胞核心方法比较【检】引导学生总结本节课内容【练】完成课后案第2课时将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定课后案1．如图是将人的生长激素基因导入细菌B内制备“工程菌”的过程。下列说法正确的是（

）A．将人的生长激素基因导入细菌B常用的方法是农杆菌转化法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只有导入了普通质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只有导入了重组质粒的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因【答案】B【分析】质粒上的标记基因可用于筛选含有重组质粒的受体细胞。将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，导入植物细胞常用农杆菌转化法。【详解】A、将重组DNA分子导入细菌B之前，一般要先用氯化钙处理细胞，农杆菌转化法是将重组DNA分子导入植物细胞时常用的方法，A错误；B、由于重组质粒中的抗四环素基因被破坏，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入普通质粒A的细菌，B正确；C、质粒A中含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，而重组质粒中含抗氨苄青霉素基因，则含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入了质粒A或重组质粒的细菌，而其他的细菌则不能生长，C错误；D、目的基因（人的生长激素基因）成功表达的标志是受体细胞能产生出人的生长激素，D错误。故选B。2．下列关于基因工程及基因表达过程的描述，错误的是（

）A．连接酶和聚合酶都是连接磷酸二酯键，但它们催化的底物不同B．运输目的基因的载体上常有标记基因，便于重组分子的筛选C．聚合酶与位于基因上游的起始密码子结合后起始转录D．农杆菌转化法需将目的基因插入质粒的上进而整合到受体细胞的上【答案】C【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。【详解】A、DNA连接酶催化DNA片段之间的磷酸二酯键，DNA聚合酶催化形成脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，它们都是连接磷酸二酯键，但它们催化的底物不同，A正确；B、运输目的基因的载体上常有标记基因，便于重组DNA分子的筛选，B正确；C、RNA聚合酶与位于基因上游的启动子结合后起始转录，起始密码子位于mRNA上，C错误；D、农杆菌转化法需将目的基因插入Ti质粒的TDNA，TDNA转移到受体细胞中并整合到受体细胞的染色体DNA上，D正确。故选C。3．《诗经》中有“投我以木瓜，报之以琼瑶”的诗句。番木瓜易感染番木瓜环斑病毒（英文缩写为PRSV）而获病。我国华南农业大学的科研人员利用农杆菌转化法，成功培育出转基因番木瓜“华农一号”，大致流程如图所示。下列分析错误的是（

）A．过程②用限制酶BamHⅠ在Ti质粒切开一个切口暴露出两个游离的磷酸基团B．过程③将重组质粒转入农杆菌之前，需先用Ca2+载体处理农杆菌C．过程⑤产生的木瓜植株即使有抗PRSV基因也不一定具有抗PRSV的性状D．农杆菌能在自然条件下能够侵染双子叶植物【答案】B【分析】分析题图：图中①为逆转录过程，②为基因表达载体的构建过程，③④是采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，④是再分化过程。【详解】A、②为基因表达载体的构建过程，用限制酶BamHⅠ在Ti质粒切开一个切口，会断裂两个磷酸二酯键，暴露出两个游离的磷酸基团，A正确；B、Ca2+载体是激活重构胚的，需用Ca2+处理农杆菌，使其处于感受态，B错误；C、若过程⑤产生的木瓜植株有抗PRSV基因，但该基因没有表达的话，也会具有抗PRSV的性状，C正确；D、农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，D正确。故选B。4．科研人员通过PCR技术获得白蛋白基因启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建基因表达载体，培育出在肝细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列叙述错误的是（

）A．常用受精卵作为目的基因的受体细胞，以培育转基因小鼠B．基因表达载体中的标记基因用来筛选含目的基因的受体细胞C．可通过PCR技术检测转基因小鼠是否转录出了目的mRNAD．将发育到囊胚期或原肠胚期的胚胎移植给受体小鼠【答案】D【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达。【详解】A、常用受精卵作为目的基因的受体细胞，以培育转基因小鼠，A正确；B、基因表达载体中的标记基因便于重组DNA分子的筛选，故可用来筛选含目的基因的受体细胞，B正确；C、可通过PCR技术检测转基因小鼠是否转录出了目的mRNA，C正确；D、胚胎移植需要胚胎发育至桑葚胚或囊胚阶段，D错误。故选D。5．下图是研究人员利用耐盐碱植物中的耐盐基因培育耐盐水稻新品系的流程图。下列相关的说法中，错误的是（）A．阶段Ⅰ和阶段Ⅱ分别是重组DNA技术和植物组织培养技术B．可利用抗原抗体杂交技术对耐盐基因的表达产物进行检测C．可通过PCR对耐盐基因是否导入水稻细胞进行检测D．用高盐溶液培养水稻细胞c属于分子水平上的检测手段【答案】D【分析】分析题图：图示为科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因培育耐盐水稻新品系的过程，其中a为目的基因，b为基因表达载体，c为受体细胞，d为转基因植